Штамм бактерий bacillus suвfilis, осуществляющий деградацию 2, 4-дихлорфеноксиуксусной кислоты

(51) 5 С ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН СВИД СТВУЕТЕЛЬ К АВТОРСКОМУ кирского научения АН СССР С.Никитина, , И, В, Кусова, ва, Р, Н. Хлест- бидуллин пбег М.,1969, ч,А 1 ехев Испольческом 5.С 0 08 ДЕ ГРАУ КСУС.Л. А, орган 299-.3ВА ЩИЙ ОКСИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Институт биологии Башного центра Уральского отдел(54) ШТАММ БАКТЕРИЙЯОВТЮЯ, ОСУЩЕСТВЛЯЮДАЦИЮ 2,4-ДИ.ХЛОРФЕННОЙ КИСЛОТЫ Изобретение относится к биотехнологии и касается получения штамма бактерий,осуществляющего микробиологическое разочшение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и ее амин ной соли (2,4-Д/А),используемых в качестве гербицидов дляборьбы с сорняками на посевах хлебныхзлаков, и может быть использован для очистки сточных вод от 2;4-Д.Известен штамм бактерий АгйгоЬастегзр;, участвующий в биологической деградации 2,4-0. Известен штамм грибаАзрегцИцз идег, способный использовать2,4-Д в качестве единственного источникауглерода и энергии,Недостатком известных штаммов является то, что для них не установлена эффективность деградации 2,4-Д, достигаемая в 2(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается получения штамма бактерий, осуществляющего микробиологическое разрушение 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2.4-Д) и ее аминной соли, используемых в качестве гербицидов для борьбы с сорняками на посевах хлебных злаков. Штамм может быть использован для очистки сточных вод.от 2,4-Д. Целью изобретения является получение штамма бактерий ВасИцззцМ 1 з АКМ ВД (шт. 16); способного осуществлять эффективную биологическую деградацию гербицида 2,4-Д. Штамм способен почти 2,сут культивирования на сточных водах производства гербицида разгружать до 90 хлорфенолов в среде при их исходной концентрации 30 мг/л; при этом продукты метаболизма, накапливаемые в среде, нетоксичны для проростков растений, 3 табл.. результате ее метаболизма в условиях куль.тивирования штаммов в жидких средах.Оцениваемый эффект касается скорости минерализации 2,4-Д и токсичности продуктовдеградации.Цель изобретения - получение штаммабактерий ВасИцз зцЬйз ВКМ ВД(штамм 16), способного осуществлять эф фективную биологическую деградацию гер-,бицида 2,4-Д.Штамм выделен из активного ила БОС(биологических очистных сооружений) производства хлорфенолов .метрдом накопительных культур.Штамм хранят в лиофилизированномсостоянии, Проверка жизнеспособностиштамма проводится высевом на мясо-пептонный агар один раэ в 12 мес, 17422265 10 20 25 30 40 45 50 55 Штамм имеет следующую характеристику,Культурально-морфологические признаки, Клетки представляют собой грамположительные подвижные палочки диаметром 1 мкм, одиночные и в парах, Споры овальные, расположенные в центре клетки. При росте на мясо-пептонном бульоне образует развитую матовую пленку, среда при этом остается прозрачной, При встряхивании биомассы в жидкой среде ее полного диспергирования не происходит, На среде Эшби образует клейстеровидные, конусообразные гладкие колонки с ризоидным краем. На ломтиках картофеля рост обилен в виде колоний кремового цвета,гладких, сильно крупноскладчатых.Физиолого-биохимические признаки.Сбраживает сахарозу, арабинозу, маннозу,маннит, сорбит, использует цитрат и малонат натрия, лизин, Не использует лактозу, рамнозу, галактоэу, фенилаланин, не активен в отношении мочевины, орнитина, эргинина, Активно гидролизует желатину,причем происходит разжижение всего столбика. Активно гидролизует казеин и крахмал. Молоко свертывает и пептонизирует без изменения реакции среды.. Проявляет нитратредуктазную активность, Реакция Фогес-Проскауэрэ положительная. Клетки каталазоположительны. Не продуцирует свероводород и индол, Лецитиназная реакция отрицательна,Не требует присутствия в среде факторов роста; растет на среде с эммонийным и нитратным азотом и сахарозой, а также на среде без специального внесения источника азота. Растет в присутствии 70 ИаО в мясо-.пептонном агаре. Чувствителен к пенициллину, феноксиметилпенициллину, канамицину, ампициллину, карбенициллину, эритромицину, олеандомицину, линкомицину, ристомицину, тетрациклину, стрептомицину. мономицину, гентамицину, незамицину, рифампицину, физидиевой кислоте, Высокочувствителен к хлорамфениколу. Устойчив к полимиксину. Для штамма характерен аэробный рост за исключением роста в среде с нитратами (жидкая среда Гильтая), Температурный диапазон роста от 20 д 60 С при 10 С рост практически отсутствует, при 55 С рост умеренный; оптимальная температура роста 30-37 С. Рост возможен в области рН от 4 до 9, оптимальный диапазон 7-8. Штамм не патогенен для человека и животных,Данные по росту штамма в условиях периодической культуры в среде с разными концентрациями 2,4-Д/А приведены в таблице 1.Для определения числа клеток пробы, отобранные после 3, 7, 14, 21 и 30 сут культивирования в жидкой среде с добавлением 2,4-Д/А в качестве единственного источника углерода и энергии, разводят в зависимости от плотности клеточной суспензии и аликвоты этих разведенных проб высевают на агаризированную мясо-пептонную среду, разлитую в чашки Петри, Чашки Петри инкубируют в течение 16 - 18 ч при 30"С и затем подсчитывают количество выросших колоний. Подсчет количества клеток в 1 мл исследуемой суспензии проводят по форму- ле э 10"/где М - количество клеток в 1 мл;а - среднее число колоний при высеве данного разведения;10 - коэффициент разведения;и - порядковый номер разведения, из которого сделан высев;Ч - обьем высеваемой суспензии, взятый для посева, мл,Штамм сохраняет жизнеспособность в диапазоне концентраций 2,4-Д/А до 10 г/л.На 3-суточных проростках кукурузы проводили тестирование продуктов метаболизма 2,4-Д, накапливаемых в культуральной жидкости штамма.Для этого делают отборы культуральной жидкости через определенные промежутки времени культивирования штамма В. зоЬб 1 з ВД в следующих условиях, Посевной материал получают выращиванием штамма в пробирках в мясо-пептонном бульоне при 30 С. Полученный посевной материал засевают в количестве 0,01 О от объема в жидкую среду следующего состава: ЙН 4 С 1 гК 2 НРО 4 5 г; МцС 12 4 Н 20 0,3 мг, МдЯ 047 Н 20 50.мг; г е 504 7 Н 20 5 мг; СоЯО 4 5 Н 20 1 мг; ЕпЯО 4 0,8 мг на 1 л; рН 6,8-7.0, В среду вносят 100 мг 2,4-Д, Культивирование про,водят при 30 С.Культуральную среду освобождают от клеток штамма центрифугированием аликвот среды при 5 тыс.об. в мин в течение 15 мин, После этого среда готова для тестирования. Проростки кукурузы линии ВИРпроращивают в течение 3 сут при 25-26 С, Отбирают проростки, имеющие одинаковую длину центрального корешка. Длина корешка должна составлять 3,0+0,2 см, Проростки помещают в чашки Петри по 10 шт, в каждую, Предварительно на дно чашки Петри помещают фильтровальную бумагу и наливают в каждую чашку по 10 мл подготовленной для тестирования культуральной среды, разбавленной в 10 раз. Чашки с проростками инкубируют при 25-26 С в.течение 3 сут и после этого замеряют длину центрального корешка каждого проросткэ и определяют среднее значение для каждого варианта опыта. Контролем является среднее значение длины центрального корешка кукурузы, инкубированной с водой,Определяют среднее значение увеличения длины центрального корешка проростков кукурузы для каждого опыта и подсчитывают процентное отношение увеличения средней длины центрального корешка проростков в опытах с метаболитами к увеличению средней длины в контроле.Эта величина обозначается какХ -- 100%,где 1 и - средняя длина центрального корешка проростка кукурузы для каждого опыта с мета болитами:- средняя длина центрального корешка проростка кукурузы в контроле;о - средняя длина центрального корешка проростка кукурузы в начале опыта.В табл, 2 приведены результаты опытов по оценке токсического эффекта на проростки кукурузы метаболитов 2,4-Д, накапливаемых в процесе культивирования штамма. Средняя длина центрального ко-, решка проростка кукурузы после инкубации на воде без добавления культуральной жидкости принята за 100% и служит контролем.Условия тестирования (разведение проб культуральной жидкости: фаза развития проростков) подобраны так, чтобы для проб культуральной среды, отобранных до начала культивирования штамма, рост корешков составлял 50% от контроля,Из табл. 2 видно, что культуральная жидкость, отобранная после 3 сут культивирования штамма, оказывает тормозящее действие на рост корешков кукурузы и увеличение центрального корешка в данном опыте составляет 55,6% от контроля, Далее, с уменьшением количества 2,4-Д на 7-е сутки культивирования штамма тормозящее действие культуральной жидкости уменьшается и средняя длина центрального корешка составляет 71,8% от контроля, С уменьшением количества 2,4-Д на 11-е сутки культивирования эффект торможения роста корешков снижается и увеличение средней длины центрального корешка составляет 85,9% от контроля.Таким образом, ингибирующий эффект действия 2,4-Д, оцениваемый в начале опыта в 50%, снижается с уменьшением количе Анализировали содержание 2,4-Д в культуральной жидкости в процессе роста штамма, Условия культивирования описаны, среда содержит 100 мг/л 2,4-Д . Анализ содержания 2,4-Д проводят методом газо-жидкостной хроматографии, Для анализа отбирают по 10 мл. культуральной жидкости через определенные промежутки времени. Клетки удаляют из среды центрифугированием при 5 тыс,об. в мин втечение 15 мин, жидкость подкисляют добавлением нескольких капель солянОй кислоты и проводят 3-кратную экстракцию 2,4-Д равными объемами хлороформа, После экстрэкции хлороформ удаляют отгонкой на вакуумном роторном испарителе, метилируют и фрак 20 ционируют на хроматографе ЛХМД с ионизэционно-резонансным детектором.Условия определения: стеклянные спиральные колонки 110 х 0,3 см с 3% очили 5% оч-.1 на инертоне супер (0,16 - 0,20 мм),25 температура испарителя 210 С, детектора 190 С, колонки 160 С, расходгелия 60 мл/мин..В результате анализов установлено, что на 7-9-е сутки культивирования штамма остаточное количество 2,4-Д составляет около 30 50%, на 10 - 14-е сутки культивирования -. около 20%.45 П р и м е р. Используют сточную водупроизводства гербицида 2,4-Д после обесфеноливания со стадии хлорирования фенолсодержащих вод из сборника; В такой воде, которая направляется непосредственно на БОС, содержание хлорфенолов составляет в среднем 30 мг/л.:В одну из колб объемом 250 мм вносят 100 мл сточный воды, в другую - 100 мпсточной водь 1 и следующие соли, г/л: КМОз20 КН 2 Р 04 0,3 Йа 2 НР 04 0,3 гчаН 2 Р 04 12 Н 20 0,7 М 9804 7 Н 20 0,4 рН доводят до 7,0-7,2 добавлением 5%-ного раствора. Колбу засевают 3% по объему посевным материалом 107 кл/мл, выращивание проводят нэ качалке(220 об./мин) при 30 С.Количество хлорфенолов определяют. в процессе культивирования на спектрофтометре при длине волны 273 - 279 нм после их экстракции из проб в СО 4 (табл, 3). 50 55,Как видно из приведенных данных,штамм активен в реальных стоках производствэ гербицида. Степень биологической очистки после 2 сут культивирования соства гербицида в процессе культивированияштамма, а накапливаемые продукты метаболизма не оказывают токсического действия на проростки кукурузы,"1742226 Таблица 1 чашечным методом Ко в аб 2 блица 3 оставитель А, Минее актор Н. Яцола Техред М,Моргентал Корректор Т. Палий каз 2256 ТиражВНИИПИ Государственного комитета по изо113035, Москва. Ж, Ра Подписноеениям и открытиям при ГКНТ СССкая наб., 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгор гарина, 101 ставляет: в сточной воде более 33 О, в сточной вода с добавлением питательных солей 906Полученные данные свидетельствуют о том, что штамм В, эиЬМ 1 э ВКМ ВД способен активно метаболиэировать гербицид 2,4-Д, при этом продукты метаболизма,накапливаемые в среде, нетоксичны дляпроростков растений. формула изобретения5 Штамм бактерий ВасНоэ эцЬтПэ ВКМВД, осуществляющий деградацию 2,4 дихлорфеноксиуксусной кислоты.