Способ определения холина в биологических объектах

О П И-;" А Н И Е ИЗОбРЕТЕН ИЯ 322163 Ссюа Сосетскнх Социалистических РеслубликК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Зависимое от авт. свидетелЗаявлено 15.Х 1.1971 ( 17с присоединением заявки тва. Кл. В 010 15/08 774 р 33-15) пори т оюитет ло дела обретений и открытий УДК 636:543.544:577. .164.18 (088.8) публиковано 1,Ч,1973. Бюллетеньгта опубликования описания 29 Л 1,19 овете Министров СССР Авторизобретен А.Д, Пе ый научно-иссле омбикормовой п Заявитель Всесою вательскии институмышленности СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛИ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТА ления холина в лючающий раз, гидролиз фосна бумаге метоличественное опй недостаток - 61 ч 1 соляной киса для приготовтанол - диэтиленфицитные химиИзобретение относится к области животноводства,Известный способ опредебиологических объектах, вкмельчение исследуемой тканифатидов, отделение холинадом хроматографии и его коределение имеет существеннына гидролиз холинфосфатидовлотой затрачивается 48 час,ления подвижной фазы н-бугликоль - вода требуются деческие реактивы. С целью сокращения времени гидролиза и повышения точности определения по предлагаемому способу гидролиз фосфатидов производят насыщенным раствором гидрата окиси бария, а для отделения холина используют подвижную фазу н-бутанол - уксусная кислота - вода, в соотношении 144: 13: 43. При этом количество холина определяют элюацией проявленных фосфомолибдатом пятен холина смесью метанол - уксусная кислота, в соотношении 4: 1, а при калориметрировании к элюату добавляют 0,5 мл 0,4-ного хлористого олова в 31 ч 1 соляной кислоте.Предлагаемый способ определения холина в биологических объектах заключается в следующем. Анализируемую ткань в количестве 10 г гомогенизируют (для мучнистых кормов животного происхождения эту операцию не производят), экстрагируют три раза по 30 мин сме сью хлороформ - этанол (2: 1), чтобы отношение общего объема экстрагирующей смеси к весу ткани составляло 20: 1. Затем экстракт выпаривают досуха при пониженном давлении на водяной бане, к остатку добавляют 30 м г 10 насыщенного раствора гидрата окиси бария ипроводят гидролиз в кипящей водяной бане в течение 2 час. Охлажденную после гидролиза смесь нейтрализуют 20 оо-ным раствором уксусной кислоты по фенолфталеину, фильтруют 15 для отделения жирных кислот и выпариваютснова досуха, Осадок растворяют в 0,5 - 1 юг соляной кислоты рН - 1, переносят в конические пробирки и при необходимости центрифугируют20 На линию старта в 2,5 см от нижнего краялиста хроматографической бумаги (18 Х 50) микропипеткой наносят по 0,01 - 0,02 мл растворы образцов и холин - хлорида - свидетеля - в виде пятен диаметром 0,5 - 1 см на 25 расстоянии 4 см друг от друга. Нанесенныепробы на бумагу подсушивают в токе холодного воздуха при помощи фена. Бумагу помещают в камеру и проводят хроматографирование в течение 24 час восходящим способом, 30 применяя подвижную фазу: н-бутанол - уксус.377163 Т 0 Предмет изобретения Составитель В, фогельман Текред 3. ТараненкоКорректор Н. Стельмах Редактор В. Новоселова Заказ 1748/8 Изд. ЛЪ 1437 Тираж 678 Подписное Ш 1 ИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр, Сапунова, 2 ная кислота - вода (144: 13: 43), которую наливают за 1 час до начала работы.Хроматограмму вынимают из камеры, сушат 30 мин при комнатной температуре и 20 мин при 100 С в термостате. Затем быстро ее погружают в 2 о/о-ный раствор фосфомолибденовой кислоты на 1 мин, после чего промывают в проточной воде 5 мин и высушивают при комнатной температуре. Окрашенные в желтый цвет пятна обводят карандашом, вырезают, измельчают ножницами и элюируют 5 мл смеси метанол: уксусная кислота (4: 1) в течение 1 час при 3 С три раза (1-й раз - 1,5 мл; 2-й - 1,5 мл; 3-й - 2 мл), После каждой элюации пробирки центрифугируют и элюаты объединяют. К элюату добавляют 0,5 мл 0,4-ного раствора хлористого олова в ЗХ соляной кислоте, доводят объем до 5 мл элюирующей смесью и измеряют оптическую плотность при 350 - 360 ммк на ФЭКе с рабочей длиной кюветы 10 мм. Рассчитывают концентрацию холина по калибровочной кривой, построенной путем хроматографирования различных количеств холин-хлорида, рабочий раствор которого содержит 10 мг стандарта в 1 мл,Для качественной оценки холина хроматограмму после обработки раствором фосфомолибденовой кислоты и промывания слегка протягивают через свежеприготовленный 0,4 о/оный раствор хлористого олова в ЗХ солянойкислоте. Проявленные пятна имеют темно-синий цвет с четкими границами на голубоватом фоне (Р - 0,31).5 При размерах камеры 55 Х 25 Х 20 анализируют одновременно 15 - 20 образцов в течение30 час,Ошибка метода + 5,1. Способ определения холина в биологических объектах, включающий размельчение исследуемой ткани, гидролиз фосфатидов, отде ление холина на бумаге методом хроматографии и его количественное определение, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени гидролиза и повышения точности определения, гидролиз фосфатидов производят на сыщенным раствором гидрата окиси бария, адля отделения холина используют подвижную фазу н-бутанол - уксусная кислота - вода, в соотношении 144: 13: 43.2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что 25 количество холина определяют элюацией проявленных фосфомолибдатом пятен холина смесью метанол - уксусная кислота, в соотношении 4: 1, а при колориметрировании к элюату добавляют 0,5 мл 0,4-ного хлористого 30 олова в 3 М соляной кислоте.