Способ определения глутаматоксалацетаттрансаминазы или глутаматпируваттрансаминазы

4 С 01 И 33 Н ПАТЕНТ ГЛУТАМАТ ИЛИ ГЛУТА ся к клинизначено для Ф 45 айм ГмбХ (ОЕ) Петер Штальлацетаттран- аттрансамипределения. ение спосот пируват и буферныйВ реака, 28, 1970а, 2, 197,нобутиратгид - детометриро активностьэы, 4 табл. СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ ПИСАНИЕ(72) Ульферт Денеки Вальтер Шнайдер(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСАЛАЦЕТАТТРАНСАК 1 НАЗЫ МАТПИРУВАТТРАНСАМИНАЗЫ (57) Изобретение относит ческой биохимии и предна определения глутаматокса саминазы и глутаматпирув назы и реагента для их о Цель изобретения - ускор ба. К глутамату добавляю -аминобутират. При этом раствор имеет рН 7,0-9,0 ционную смесь вносят ами трансаминазу и семиальде гидрогенаэу, Производят ванне. Затем рассчитываю глутаматпируваттрансаминИзобретение относится к способамопределения активности фермента глутаматоксалацетаттрансаминазы (СОТ)и глутаматпируваттрансаминазы (СРТ),а также к реагентам, пригодным дляпроведения этого способа и можетбыть применено для определения названных ферментов в биологических жидкостях, таких как сыворотка, мочаили в др.Цель изобретения - ускорение анализа.Определение глутаматоксалацетаттрансаминазы или глутаматпируваттрансаминазы осуществляют путем инкубации исследуемого фермента с глутаматом в буферном растворе с последующим фотометрированием, для чего50 ммоль/л глутамата предварительновводят во взаимодействие с 0,в50 ммоль/л оксаната или пирувата соответственно в буферном растворе срН 7,0-9,0, далее в реакционнуюсмесь вносят 10-300 ммоль/л-аминобутирата с 500-2000 Ед/л аминобути -раттрансаминазы, затем добавляют семиальдегиддегидрагеназу, Полученныйвосстановленный НАПР фотометрируют,Способ осуществляют следующим образом.Комбинируют реакции по уравнениямГАВ-СТа-Кй-аминобутират ---сукцинатсемиальдегид +-глутамат, гдеСАВ-СТаминобутираттрансаминаза;,сукцинатсемиальдегид + БАЭР в85 -А 1-ВНФсукцинат + 1 тАЭРН + Н, гдеБЯ -А 1-ЭН сукцинатсемиальдегиддегидрогенаэа,и осуществляют реакцию, которуюпроводят с солью тетраэола в присутствии переносчика электронов дляповторного окисления НАЭРН при одновременном образовании окрашенногоформазана, который легко можно измерить в видимой части спектра. Этосоответствует уравнению:+ КАОР ,где МТТ = 3-(4,5-диметилтиазолйп)-2,5-дифенилтетразолилабромид,Способ проводят при рН 7-9,5.При более высоких и более низкихзначениях рН происходит существенноезамедление реакции с соответствующим удлинением времени, необходимого для проведения одного теста. Самые хорошие результаты получают призначениях рН в интервале 8-8,6.Пригодная концентрация буфера лежит в интервале 5-0,5 моль/л, что5 соответствует концентрации буфернойсоли в тесте 0,05-б . Предпочтительно использование буфера концентрацией 10-100 ммоль/л.В качестве соли тетраэола испольО эуют МТТ.Хорошие результаты получены с хлоридом нитроголубого тетразола (БВТ)ихлоридом 2-(и-йодофенил) -3-(и-нитрофенил)-5-фенилтетраэола (1 М 7).При измерении красителя формазана целесообразно добавлять поверхностно-.активные вещества, которые улучшаютрастворимость красителя.В примерах используют сокращения:20 СРТ - глутаматпируваттрансаминаэа;САВ-СТ --аминобутираттрансаминаза;ЯБ-А 1-ПН - сукцинатсемиальдегид 25 дегидрогеназа;СОТ - глутаматоксалацетаттрансаминаза,БАЭР - никотинамидадениндинуклеотидфосфат;30 МАЭРН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный;МТТ - 3-(4,5-диметилтиазолил)- -2,5-дифенилтетраэолила бромид;Трис - трис(оксиметил)-аминометан;Тритон ВХ 00 - алкиларилполиэтиленгликолевый эфир.П р и м е р 1. Определение СРТ.Образование ИАОРН является сигналомизмерения. Температура 25 С, длинаволны 365 нм, тестовый объем 3 мл,1-сантиметровая кювета.Данные приведены в табл .1.Исходный раствор перемешивают,Начинают реакцию с 0,5 мл сыворотки45 (СРТ-обогащенная), перемешивают,2 мин инкубируют, снимают показанияЕ, через 1,2,3 и 4 мин точного времени, далее снимают показания ЕЕзу Е 4 и Е,50На основании полученных данныхрассчитывают значение Е/мин.Активность СРТ в пробе рассчитывают по формуле55 Ед/мл = --- = Е1,714.Е 7Яа 7 П р и м е р 2. Определение СРТ.Образование формазана выбирают вкачестве сигнала измерения. Температура 25 С, длина волны 578 нм, тестовый объем 3 мл, кювета толщиной 1 см.В кювету пипеткой вводят вещества, укаэанные в табл,2.Исходный раствор перемешивают.Начинают реакцию с 0,1 мл сыворотки (СРТ-обогащенная), перемешивают, 2 мин инкубируют, снимают показание Е через 1, 2, 3 и 4 мин точного времени. Далее снимают показания Е, Е, Е 4 и Еэ, на основании которых рассчитывают значение СРТ Е/мин.Активность в пробе рассчитывают по следующей формуле:Е ЧЕд/мл = в в= д Е 1,796ЕЧП р и м е р 3, Определение СРТ. Образование ИАОРН принято в качестве сигнала измерения. Температура измеорения 25 С, длина волны измерения 365 нм, тестовый объем 3 мл, кювета толщиной 1 см.В кювету пипеткой вводят вещества, представленные в табл.З.Исходный раствор перемешивают, Реакцию начинают с 0,5 мл сыворотки (СОТ-обогащенная), перемешивают, 2 мин инкубируют, снимают показание Е, через 1, 2, 3 и 4 мин точного времени, далее снимают показания Е, 1-, Е 1, Еэ. На основании полученных данных рассчитывают дЕ/мин.Активность СОТ в пробе рассчитывают по ФормуледЕ 7 ЧЕд/мл = --- , - = д Е 1,717П р и м е р 4. Определение СОТ. Образование формазана принято в качестве сигнала измерения. ТемпераОтура 25 С, длина волныизмерения 578 нм, тестовый объем 3 мл, кюве,та толщиной 1 см.Исходный раствор перемешивают,Реакцию начинают с 0,05 мл сыворотки(СОТ-обогащенная), перемешивают,2 мин инкубируют, снимают показаниеЕ, через 1, 2, 3 и 4 мин точноговремени, далее снимают показанияЕ , Е, Еи Еэ, Активность СОТ в пробе рассчитывают по формуледЕ 7ЕД/мл = ---- = дЕ 3 593,7 р ЗО Формула изобретения Способ определения глутаматоксалацетаттрансаминазы или глутаматпируваттрансаминазы путем инкубации исследуемого фермента с глутаматом в буферном растворе с последующим фотометрированием, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью ускорения анализа, 50 ммоль/л глутамата предварительно вводят во взаимо-:действие с 0,1-50 ммоль/л оксаната или пирувата соответственно в буферном растворе с рН 7,0-9,0, далее в реакционную смесь вносят .1 О - .300 ммоль/л-аминобутирата и 500- 2000 Ед/л аминобутираттрансаминазы, затем добавляют семиальдегиддегидрагенаэу; полученный восстановленный БАЭР Фотометрируют. 50 5П р и м е р 5. Определение СРТна тестовой полосе.Пригодную бумагу пропитываютраствором, содержащим все реагенты,приведенные в примере 2, осторожно сушат, укрепляют на п 1 игодномносителе, запечатывают и разрезаютна полосы, После погружения в сыворотку появляется красно-голубое ок -рашивание, интенсивность которогопропорциональна активности СРТ впробе. Оценку можно проводить сравнением с пригодной шкалой стандартного окрашивания, а также с помощьюотражательного Фотометра.П р и м е р 6, Определение СОТна тестовой полосе.Пригодную бумагу пропитываютраствором реагентов, приготовленнымпо примеру 4, осторожно высушивают,укрепляют на пригодном носителе,при необходимости запечатывают и разрезают на полосы. После .погруженияв сыворотку появляется красно-голубое окрашивание, интенсивность когорого пропорциональна СОТ-активностив пробе. Оценку можно проводить сравнением с пригодной шкалой стандартной окраски, а также с помощью отражательного фотометра,1276269 Таблица 4 Количество Исходный раствор 1,5 0,9 (0,067) БАРР, 27. ммоль/л (2%) 0,1 0,3 90 (0,9) 0,3 60 (0,88) 0,65 (0,00917) 0,1 0,2 0,1 (0,00414) ИСАВ-СТ, 86 Ед/мл(0,0017%) 0,24 Н Составитель Н,Хрусталева Техред А.Кравчук Корректор Л,Пилипенко Редактор Н.Яцола Заказ 6586/60 Тираж 778 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Х, Раушская наб. д. 4/5