Способ определения активности иммуномодулятора

)5 6 01 й ЗЗ/8 ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ НОпомещают в раствор этиуксусной кислоты (10 мл АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) 2-й Московский государственный медицинский институт им. Н,ИЛирогова72) М.А.Стенина, А.Ю.Скрипник и А.А.Зернов(56) Методические материалы по экспериментальному (фармакологическому) иклиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологическихсредств. МЗ СССР, Фармакологический Комитет, 1984, с. 5-10,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВСТИ ИММУНОМОДУЛЯТОРА(57) Изобретение относится к области медицины, в частности к клинической иммуноИзобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунологии, и может быть использовано для отбора лекарственных препаратов с иммуномодулирующей активностью, а также для определения индивидуальной чувствительности к ним при назначении иммунокорригирующей терапии. Цель изобретения - ускорение и повышение точности способа за счет стандартных, единых .условий культивированияиммунокомпетентных клеток на разных полупроницаемых мембранах в единой экспериментальной системе,Способ осуществляется следующим образом,10 мл кровилендиаминтетра логии, и может быть использовано для отбора лекарственных препаратов и для определения индивидуальной чувствительности к ним при назначении иммунокоррегирующей терапии, Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа за счет того, что при добавлении исследуемого иммуномодулятора в среду с иммунокомпетентными клетками создаются единые условия культивирования путем помещения клеток на разные полупроницаемые мембраны, а их культивирование проводят в единой экспериментальной системе, Это исключает ошибки, связанные с изменением функциональной активности клеток, культивируемых в различных условиях, что повышает точность способа, при этом способ ускоряется в 2,5 раза. 4 табл. рови на 2 мл 2,7-ного раствора), разводятаствором Хенкса без Са, Мо, наслаи-вают на раствор фиколла-верографина, име- (, ющий плотность 1,077. После О центрифугирования при 400 об/мин 45 мин собирают мононуклеарные клетки, концентрировавшиеся над слоем фиколла, отмывают фосфатным буфером (1500 об/мин, 15 мин, три раза), ресуспендируют в среде Ю культивирования, содержащей антибиотики и 20 инактивированной человеческой сыюый воротки ч группы, доводят концентрацию клеток до 10 х 10 в мл. Часть мононуклеарных клеток используют для выделения фракции Т-лимфоцитов, Для этого 4 х 10 мононуклеарных клеток соединяют с равным объемом 1-ной взвеси эритроцитов барана, центрифугируют при 1000 об/мин10 20 25 30 40 50 55 10 мин, выдерживают 60 мин при+4 С, осторожно ресуспендируют и наносят на новую порцию фиколла. Центрифугируют при 400 об/мин 45 мин, собирают фракции, сконцентрировавшуюся на дне пробирки, добавляют к ней 1 мл дистиллированной воды для лизиса эритроцитов, отмывают в фосфатном буфере (1500 об/мин, 10 мин), ;ресуспендируют в среде культивирова ния ибдоводят концентрацию Т клеток до ,10 х 10 вмл,В два, сосуда со средой культивирования помещают по пять полупроницаемых мембран (1, 2, 3, 4, 5), На мембраны 1 и 2 обоих сосудов помещают фракцию Т-клеток в объеме 0,05 мл, а на мембраны 3, 4, 5 обоих сосудов - фракцию мононуклеарных клеток в таком же объеме, Среду культивирования сосуда 1 (опыт) дополняют иммуномодуля тором в соответствующей концентрации. В среду культивирования сосуда 2 (контроль)добавляют такое же количество среды куль тивирования, Сосуды с помещенными в нихмембранами выдерживают при +37 С 48 ч,После этого вынимают мембраны 1, 2, 3, 4из обоих сосудов, а в среду культивирования , сосуда 1 и 2, в которой остались мембраны ,5, добавляют Н-тимидин и культивируют еще 4 ч,На мембранах 1 опытного и контрольного сосудов определяют экспрессию рецептора для Гс фрагмента 1 дб на Т-клетках, Для этого мембраны помещают в пробирки, содержащие 1 ф-ную взвесь эритроцитов быка, сенсибилизированных кроличьим ц 6, выдерживают при+37 С 15 мин, а затем при +4 С 1 ч. Находящиеся на мембранах клетки фиксируют 200 ь-ным раствором формалина и окрашивают гематоксилин-эозином общепринятым способом. В световом микроскопе подсчитывают процент розеток, образовавшихся на мембранах в присутствии и отсутствии иммуномодуляторов.На мембранах 2 опытного и контрольного сосудов определяют внутриклеточное содержание циклического АМФ в Т-лимфоцитах в присутствии и отсутствии иммуномодулятора. Для этого мембраны подвергают многократному замораживанию и оттаиванию в ЭДТА-буфере для разрушения Т-клеток. Дальнейшее определение циклического АМФ проводят по методике, предлагаемой фирмой Авегзпав, поставляющей наборы для определений циклических нуклеотидов.На мембранах 3 опытного и контрольного сосудов определяют экспрессию рецепторов для эритроцитов барана на мононуклеарных клетках. Для этого мембраны опускают в пробирки с 1-ной взвесьюэритроцитов барана, выдерживают при+ 37 С 15 мин, а затем при + 4 С 60 мин. Находящиеся на мембранах клетки фиксируют 20-ным раствором формалина и окрашивают гематоксилинэозином известным способом, В световом микроскопе подсчитывают процент розеток, образовавшихся на опытной и контрольной мембранах,На мембранах 4 опытного и контрольного сосудов определяют экспрессию рецепторов к СЗ-компоненту комплемента на мононуклеарных клетках. Для этого мембраны опускают в пробирки, содержащие 170 взвеси эритроцитов быка, сенсибилизированных антиэритроцитарными антителами и комплементом, выдерживают при +37 С 15 мин и фиксируют 20-ным раствором формалина. Окрашивают клетки гематоксилин-зозином и в световом микроскопе подсчитывают число оозеток на опытной иконтрольной мембранах,На мембранах 5 опытного и контрольного сосудов определяют способность иммуномодулятора индуциро вать и ролиферацию покоящихся лимфоцитов, Для этого мембраны отмывают от невключившегося в клетки зН.тимидина и оценивают уровень пролиферации на каждой из них радиометрическим методомП р и м е р 1. Исследовали кровь здоровогодонора описанным способом. В качестве иммуномодулятора испольэовали тактивин. Результаты оценки действия тактивина на параметры функциональной активности лимфоцитов суммированы втабл,1Данные проведенного анализа свидетельствуют, что тактивин увеличивает экспрессию Гс рецептора на Т-лимфоцитах,снижая при этом внутриклеточный уровень циклического АМФ, и не влияет на остальные исследованные параметры функциональной активности лимфоцитов.П р и м е р 2. Способом, описанным в примере 1, из крови здорового донора выделяли фракцию Т-клеток. В двух сосудах со средой культивирования размещали по 5 полупроводниковых мембран 1 - 5, на которые наносили по 0,5 мл Т-клеток. В двух сосудах со средой култивирования размещали по 5 полупроницаемых мембран (1 - 5), на которые наносили по 0,05 мл Т-клеток. Осуществляли стимуляцию Т-клеток в каждом из сосудов к пролиферации путем добавления в среду культивирования митогенной дозы (5 мкг/мл) конканавалина А и инкубации при +37 С 48 ч. Стимулиро; ванные Т- клетки переносили в два других сосуда со средой культивирования, не соПа амет нк иональной активности Внутри клеточный уровень циклического АМФ вТклетках, пмоль/10 Экспрессия рецептора для эритро цитов бара на на мононуклеа ахЭкспрессия рецептора для Рс фрагмента 1 уС на Т клетках,Пролифераивная активпонента ком племента на мононуклеа- оах г12,68,4 Мембрана ез тактивина тактивином держащей конканавалин А. Первый сосуд (опыт) дополняли иммуномодулятором (миелопид) в дозе 30 мкг/мл, а во второй (контроль) добавляли соответствующее количество среды культивирования. Через 5 24 ч инкубации при 37 С измеряли параметры функциональной активности пролиферирующих Т-клеток на каждой из мембран описан н ым способом, Резул ьтаты исследо-. вания влияния миелопида на пролифериру ющие Т-клетки представлены в табл.2.Данные проведенного анализа свидетельствуют, что конканавалин несколько увеличивает пролиферативную активность Т-лимфоцитов, но не влияет на остальные 15 исследованные параметры функциональной активности,П р и м е р 3. Способом, описанным в примере 1, из крови здорового донора выделяли фракцию Т-клеток. В двух сосудах со 20 средой культивирования размещали по две полупроницаемые мембраны, на которые наносили по 0,05 мл Т-клеток, В сосуд 1 с мембранами 1 и 2 добавляли митогенную дозу конканавалина А, а в сосуд 2 с мембра нами 3 и 4 - соответствующее количество среды культивирования. Оба сосуда инкубировали при +37 С 48 ч, После этого в сосуд 3 со средой культивирования переносили мембрану 1 из сосуда 1 и мембрану 3 из 30 сосуда 2, В сосуд 4 со средой культивирования переносили мембрану 2 из сосуда 1 и мембрану 4 иэ сосуда 2. Таким образом, в каждом из сосудов 3 и 4 находятся по две мембраны, на одной из которых культивиру ются. покоящиеся лимфоциты, а на другой - стимулированные митогеном к пролиферации. В сосуд 3 (опыт) добавляют иммуномодулятор (циклоспорин) в дозе 4 мкг/мл, а в сосуд 4 (контроль) - соответствующее коли чество среды культивирования, После инкубации при +37 С 24 ч измеряли параметры функциональной активности пролиферирующих и покоящихся Т-клеток способаю описанными в примере 1. Результаты иссле дования влияния циклоспорина на пролифе рирующие и покоящиеся Т-клетки представлены в табл,3.Таким образом, исследование эффектов циклоспорина в единой экспериментальной системе позволило выявить различие его действия на покоящиеся и пролиферирующие клетки: препарат не оказывал влияния на покоящиеся лимфоциты, но стимулировал экспрессию рецептора для Гс фрагментауб на пролиферирующих клетках и несколько ингибировал их пролиферацию,Таким образом, ускорение способа достигается за счет того, что все тесты осуществляют в единой экспериментальной системе.Сравнение предлагаемого и известного способов приведено в табл.4.В предложенном способе произведена стандартизация условий выделения и культивирования исследуемых клеток (для всех иммунологических тестов клетки помещаются на одинаковые мембраны в одном сосуде), Это исключает ошибки, связанные с изменением функциональной активности клеток, культивируемых в различных условиях, что повышает точность способа. Формула изобретения Способ определения активности иммуномодулятора путем добавления его в среду с иммунокомпетентными клетками с последующим определением их функциональной активности,отличаю щи йся тем,что, с целью ускорения и повышения точности способа за счет стандартных единых условий культивирования, иммунокомпетентные клетки помещают на разные полупроницаемые мембраны, л их культивирование проводят в единой экспериментальной системе.1665310 Таблица 2 Таблица 3 Таблица 4 Иммунологический тест Культивирование и учет Итого Выделение кле- ток Способ 2 ч 1 ч 1 ч 80 ч ВОч 80 ч 4 ч 4 ч . 4 ч Известный Предложенный 90 ч Составитель И,ЕмельяненкоТехред М.Моргентал Корректор Э.Лончакова Редактор В.Данко Заказ 2389 Тираж 413 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 РБТЛ Экспрессия рецепторов Морфологической анализ Результаты анализа РБТЛ Экспрессия рецепторов Морфологический анализ Рез льтаты анализаРазнесение клеток по системам 86 ч 85 ч 85 ч 256 ч 96 ч 96 ч