Способ определения эндотоксинсвязывающей активности липопротеидов крови

%39вательская лаборат ных веществ гидро онИ,Кропач,р.17 Ке,а зо ы Ю чноции, тель- рбоистрирщщЪ ГосудАРственныИ комитетПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(56) ЗЛпГесс.Оз., 1985, ч, 52, М184,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДО СИНСВЯЗЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ПОПРОТЕИДОВ КРОВИ(57) Изобретение относится к медици именно к иммунодиагностике, Целью бретения является повышение специфи сти и ускорение способа. Из фрак содержащей ЛВП, готовят последова ные двукратные разведения в 0,01 М ка Изобретение относится к медицине, аименно к иммунодиагностике,Цель изобретения - повышение специфичности и ускорение способа определения эндотоксинсвяэывающей активности липопротеидов высокой удельной плотности (ЛВП) плазмы крови.Выделяют фракцию ЛВП из плазмы или сыворотки крови, фиксируют ее в последовательных разведениях на твердой фазе (иммунологические планшеты), добавляют к каждому разведению постоянное количество эндотоксина и инкубируют с ним. После отмывания связавшийся эндотоксин определяют при помощи антител, коньюгированных с пероксидазой, причем о связывающей активности ЛВП судят по содержанию бел 2нат-бикарбонатном буфере (рН = 9,5) и вносят в лунки полистироловых плашек. После термостатирования и промывки в каждую лунку добавляют раствор, содержащий эндотоксин, ЛВП и эндотоксин совместно инкубируют и промывают, после чего в лунки вносят коньюгат антител к эндотоксину с пероксидазой, Для выявления связавшегося коньюгата в лунки добавляют субстрат - раствор 0,04 О ортофенилендиамина в 0,05 М цитратном буфере (рН = 5,0) с добавлением 0,012 Н 202. Через 10 - 30 мин реакцию останавливают добавлением в лунки 50 О Н 2304. Э ндотокси н связы ва ющую активность оценивают по последней лунке, где визуально проявляется желтая окраска или спектрофотоматрически регистрируется эндотоксин, и выражают в количестве белка исследуемой фракции, содержащегося в этой лунке,ка в последнем разведении с рег уемым эндотоксином.П р и м е р 1. Получение эндотоксина из мутанта ЯагпопеИа п 1 ппезоса 8595, а также получение антител к эндотоксину, коньюгированных с пероксидазой, можно осуществлять любым известным методом.К образцу плазмы или сыворотки крови (1,5 - 1,0 мл) добавляют полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000 до конечной его концентрации 10,5 О, Смесь выдерживают при комнатной температуре 15 мин, затем центрифугируют при 2000 ц в течение 15 мин и собирают надосадочную жидкость, которая представляет собой фракцию, содержащую ЛВП, По данным реакции пассивной гемагглютинации фракция практически не содержит антител к эндотоксину. В собран 16015825 10 15 20 25 30 40 45 50 / При изучении 45 здоровых доноров установлено, что среднее значение зндотоксинсвязывг.ощей активности фракции ЛВП равнялось (Я + д) 36,5 + 5,6 мкг белка.П р и м е р 2. Использовалась кровь 4 доноров, из которой путем центрифугированй фракции определяют содержание белкапр Лоури,Из фракции, содержащей ЛВП, готовятпоследовательные двукратные разведенияв.;0,01 М карбонат-бикарбонатном буфере. (рН "9,5) и по 200 мкл каждого разведениявносят в лунки полистироловых плашек.Галашки выдерживают 3 ч при 37 ОС и 18-20 чри 4 С, после чего три раза отмывают дисфллированной водой. Затем для свяэывайия свободных участков полистирола вЛунки добавляют по 200 мкл 1-ного раствора БСА, выдерживают плашки 3 ч при7 С и снова отмывают трижды дистиллированной водой.В каждую лунку вносят по 200 мкл раствора, содержащего 50 мкгlмл эндотоксинай 0,02 М ЗДТА. После добавления эндоток 1 ина плашки выдерживают 1 ч при 37 С иЗатем отмывают 3 раза дистиллированнойводой с 0,05% Твееп.В лунки вносят по 200 мкл конъюгата.антител с пероксидазой, После добавленияконъюгата плашки инкубируют 1 ч при 37 С,затем 5 раз отмывают дистиллированнойводой с 0,05% Таеео.Для выявления связавшегося конъюгата антител с ферментом в лунки добавляют по200 мкл субстрата - раствора 0,04% ортофенилендиамина в 0,05 М цитратном буфере(рН = 5,0) с добавлением перед использованием 0,012% Н 202, Через 10 - 30 мин реакцию останавливают путем добавления влунки по 50 мкл 50%-ной Н 2 ЯО 4, Учет результатов проводят визуально по появлениюжелтой окраски или спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Зндотоксинсвязывающую активность оценивают попоследней лунке, в которой еще регистрируется окрашивэние, более интенсивное, чемв контроле, и выражают в количестве белкафракции ЛВП, содержащегося в лунке, Чемменьше этот показатель, тем выше энротоксинсвязывающэя активность, Контролемслужит первый ряд плашки, в который внесены все ингредиенты, кроме зндотоксинэ,ния были получены образцы плазмы. В каждом из этих образцов эндотоксинсвязывающая активность ЛВП была определена, как описано в примере 1, а также по способу прототипа (т.е. путем добавления к цельной плазме эндотоксина, меченного радиоактивным йодом, в концентрации 50 мкг/мл, инкубации втечение 1 ч при 37 С с последующим выделением фракции ЛВП путем ультрацентрифугирования и определения в ней радиоактивности и содержания белка).Полученные результаты показали, что по способу прототипа радиоактивно меченный эндотоксин выявляется в разведениях фракции ЛВП, содержащих,не менее 48,2 + 3,9 мкг белка, тогда как предлагаемым способом связанный эндотоксин обнаруживается в разведениях фракции ЛВП, содержащих не менее 32,4 + 4,1 мкг белка (значимость различий р 0,05).Это доказывает, что в цельной плазме эндотоксин связывается не только с ЛВП, но и с другими компонентами, поэтому часть его теряется при выделении фракции ЛВП. Более высокая специфичность при предложенном способе по сравнению с прототипом достигается за счет связывания эндотоксина с выделенной фракцией ЛВП,Время, затрачиваемое на анализ по способу прототипа, приблизительно в 2 - 2,5 раза больше, чем по предлагаемому способу ("О 32 ч)Формула изобретенияСпособ определения эндотоксинсвязывающей активности липопротеидов крови путем совместной инкубации биологической пробы с эндотоксином, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности и ускорения способа, в качестве пробы используют выделенную фракцию липопротеидов, которую фиксируют в последовательных разведениях на твердой фазе, после чего добавляют в каждое разведение одинаковое количество эндотоксина и после инкубации и отмывания связавшийся эндотоксин выявляют при помощи антител, конъюгированных с пероксидазой, причем эндотоксинсвязывающую активность липопротеидов характеризуют содержанием белка в последнем разведении, где еще регистрируется связанный эндотоксин.