Способ определения энтеротоксина энтеробактерий в биологическом материале

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 138842 1/ОО, С О 1 с Е ИЭОБРЕТСВИДЕТЕЛЬСТВУ ИСА Я К АВТОРСКОМ 8-14 инститит нен ьмонел,ЬЭ ОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ/тут морфологии человека АМН ССи Научно-исследовательский инсэпидемиологии и микробиологииим. Н.Ф.Гамалеи(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНТЕРОТОКСИНАЭНТЕРОБАКТЕРИЙ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ(57) Изобретение относится к медицинеЦель изобретения - повышение точностиспособа путем выявления локализациитермолабильного энтеротоксина. Дляэтого готовят гистологические срезы,затем инкубируют их с фракцией иммуноглобулинов 1 ря антиэнтеротоксической сыворотки, соединенной с пероксидазой хрена, после чего наносят диаминобензидин, контрастируют четырехокисью осмия. Энтеротоксин фиксируют в местах появления окрашивания.Антиген, термолабильный энтеротоксии энтеробактерий, выявляется насрезах бурыми гранулами и пятнамиразличной величины.Изобретение относится к медицине.Цель изобретения - повышение точности способа за счет выявления локализации термолабильного энтеротоксина. 5Способ осуществляют следующим образом.Органы, предназначенные для исиследования, режут на кусочки не более 0,5 см и опускают их на 1 чэв спирт 96" при 4 С. Затем кусочки извлекают и режут острой бритвой на кусочки не более 0,3 мм толщиной и снова опускают для дофиксации во вторую порцию спирта 96 на 24 ч 15 при 4 С. Далее их проводят по 1 чочерез 2 порции спирта 96 и через 2 порции спирта 100 при 4 С. Затем ткань обрабатывают 2 порциями ксио лола по 20 мин каждой при 4 С. После 20 этого следует проводка по 1 ч в 3 порциях парафина при 56-58 С. Затем кусочки заключают в парафин. Приготовленные парафиновые блоки хранятопри 4 С. Перед исследованием на тер молабильный энтеротоксин из парафиновых блоков готовят срезы толщиной 3-5 мкм. Непосредственно перед окраской срезы депарафинируют при комнатной температуре, для чего их 30 опускают последовательно в стаканчики с двумя порциями ксилола, затем в спирт-ксилол в соотношении 1:1 на 15 - 20 мин в каждом стаканчике. Затем проводят по спиртам 100, 96,а70, 50 по 5 мин в каждом и через 4 порции Фосфатно-буферной смеси с рН 7,2-7,4 по 5 мин в каждой порции. Перед началом окраски стекла опускают на 5- 10 мин в Фосфатно-солевой буфер 4 О с рН 7,2-7,4 при комнатной температуре.После депарафинирования для связывания энедогенной пероксидазы сре- зы помещают на 30 мин в раствор перо ксидазы хрена, приготовленный из расчета 15 мг препарата на 1 О мл фосфатно-буферной смеси при рН 7,2- 7,4, После трехфазного отмывания в фосфатном буфере срезы обрабатывают перекисью водорода на метаноле в соотношении 1:99 в течение 10 мин, После очередного трехкратного отмывания в Фосфатном буфере на испытуемые срезы наносят конъюгат, представляющий собой Фракцию иммуноглобулинов иммунной сыворотки кролика против термолабильного энтеротоксина кишечных палочек, соединенную с пероксидазой хрена. Конъюгат используют в рабочем разведении 1:100 в Фосфатном буфере. Контакт осуществляют в течение 60 мин на водяной бане при комнатной температуре. После трехкратного отмывания в Фосфатном буфере на срезы наносят свежеприготовленный субстрат. Спустя 5 мин срезы отмывают от субстрата дистиллирован-. ной водой и контрастируют 0,2-ным раствором четырехокиси осмия под контролем микроскопа. Срезы можно докрасить гематоксилином. Антиген, термолабильный энтеротоксин энтеробактерий, выявляется на срезах в виде бурых гранул и пятен различного размера.Способ подтверждается примером,П р и м е р, Мышей в возрасте 2-2,5 мес заражают перорально суточной культурой кишечной палочки штамма Н. В различные сроки после заражения (3,6,8,14, 18 и 24 ч) их умерщвляют, берут кусочки тканей из тощей, подвздошной и прямой кишки, Фиксируют в нейтральном Формалине и заливают в парафин, как описано вьш;е, После контакта исследуемой ткани с Фракцией иммуноглобулинов 188 иммунной сыворотки кролика против/термолабильного энтеротоксина кишечной папочки, соединенной с пероксидазой хрена, и контрастирования 0,2 Е-ным раствором четырехокиси осмия в исследуемых срезах выявляют антиген, термолабильный энтеротоксин кишечной палочки. Он локализовался наповерхности ворсинок,Способ позволяет определить точную локализацию энтеротоксина энтеробактерий.Формула изобретения.Способ определения энтеротоксинаэнтеробактерий в биологическом материале, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения точности засчет выявления локализации термопабильного знтеротоксина, готовят гистологические срезы, инкубируют сФракцией иммуноглобулинов 18 антиэнчтеротоксической сыворотки, соединенной с пероксидазой хрена, после чегонаносят диаминобензидин, контрастируют четырехокисью осмия и определяютэнтеротоксин в местах появления окрашивания,