Способ маркирования белка ферментом

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ УБЛИК 3/50 4 С о ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ ЗОБРЕТЕНИЯ ЕЛЬСТВУ ОПИС К АВТОРСКОМУ СВИД.:шапя Р.,1, МеЬ. 55,Маяе 1 35-4 1Сп 3. 1 шш прототип).ап С.А., Иеяятап 1 по 1., 107, 1391.19 ели,тель- ин- уда 0 ЕРМ 57) обретение относится к иммуноа именно к методам полученияванного ферментной меткой. беллотистого стафилококка, котоет быть использован в твердоиммуноферментных методах аная клинической и лабораторнойи в медицине, ветеринарии,химии,мар кирока А зорый мож зныхза длактик и,80129016 микробиологии, промышленной гигиене,криминалистике. Целью изобретения является упрощение способа и повышениеудельной активности маркированногобелка А. Маркирование белка А осуществляют добавлением к нему растворафосфомоноэстеразы Е.со 1 и антисыворотки к ферменту, что для данной партии антисыворотки соответствует условию эквивалентности. После инкубациииз полученного раствора меченого белка А готовят ряд последовательных .разведений, помещают в лунки микротитрационной полистироловой пан на стенки которых были предвари но посажены 18 С человека. После кубации несвязавшиеся комплексы ляют промыванием физиологическим раствором, в лунки заливают раство паранитрофенилфосфата, инкубируют, останавливают реакцию добавлением раствора ИаОН. Содержимое каждой л ки спектрофотометрируют при 405 нм микрокювете. Порог чувствительност по белку А 10 нг/мл.1290166 П р и м е р 2. К 1 мл забуференного физиологического раствора добавляют 35 мкл культуральной жидкости, полученной после выращивания в ней золотистого стафилококка Соыапи содержащей белок А в концентрации 30 мкг/мл, 5 мкл раствора фосфомоноэстеразы с концентрацией 1 мг/мл и 2 мкл антисыворотки к ферменту. Далее аналогично примеру 1. Порог чувствительности по белку А - 10 нг/мл. Формула изобретения Составитель В.МесянжиновТехред Л.Сердюкова Корректор Л.Пилипенко Редактор А.Ревин Заказ 7893/39 Тираж 798 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, ЖРаушская наб., д. 4/5.Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Изобретение относится к иммунохимии, а именно к методам получения маркированного ферментной меткой белка А золотистого стафилококка, который может быть использован в твердофазных иммучоферментных методах анализа для клинической и .лабораторной практики в медицине, ветеринарии, микробиологии, промышленной гигиене, криминалистике и научно-исследова тельских работах биологической направленности. Цель изобретения - упрощение способа и повышение удельной активности 15 маркированного белка А, что достигается использованием в качестве связывающего реагента антисыворотки к ферменту и проведением реакции связывания в условиях эквивалентности. 20Способ осуществляют следующим образом.П р и м е р 1. Маркирование белка А осуществляют добавлением в 1 мл физиологического раствора, забуферен ного 0,02 М трис-НС 1 рН 8,0 и содержащего 1 мкг белка А, 5 мкл раствора фосфомоноэстеразы Е.со 11 с концентрацией 1 мг/мл и 2 мкл антисыворотки к ферменту,что для данной партии анти сыворотки соответствует условию эквивалентности. После часа инкубации из полученного раствора меченого белка А готовят ряд последовательных разведений и по 0,1 мл каждого из них помещают в лунки микротитрационной полистироловой панели, на стенки которых были предварительно посажены 1 яС человека. Инкубацию проводят 1 ч при комнатной температуре. Несвязавшиеся комплексы удаляют трехкратнымпромыванием физиологическим раствором. В лунки заливают по О, 1 мл раствора паранитрофенилфосфата с концентрацией 1 мг/мл на 0,1 М трис-НСбуфере рН 9,5. Через 1 ч инкубациипри 37 С в лунки добавляют по 0,1 мл0,5 М МаОН для остановки ферментативной реакции. Содержимое каждойлунки спектрофотометрируют 405 нм вмикрокювете. Удельная активность меченого,белка А достаточна для выявления его в растворах с концентрацией не ниже 10 нг/мл. Способ маркирования белка А ферментом путем их взаимодействия в условиях эквивалентности в присутствии связывающего реагента, о т л и ч а - ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения удельной активности маркированного белка А, процесс взаимодействия белка А с ферментом осуществляют в присутствии антисыворотки к используемому ферменту.