Способ получения полинуклеотида для использования в генетических исследованиях

)5 С стве, сулечение редрасетения: ществляномнойДНК в овательитивных ем всей ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССРГОспАТент сссР) ОПИСАНИЕ ИЗОК ПАТЕНТУ(46) 15,01.93. Бюл, (71) Империал Кем (72) Алек Джон Дж (56) ОВ, 2166445, к (54) СПОСОБ ПОЛ ТИДА ДЛЯ ИСПО ЧЕСКИХ ИССЛЕД М 2икал Индастриз ПЛС (СВ)ефф рис (О В) л, С 12 0 1/68, 1985,УЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОЛЬЗОВАНИЯ В ГЕНЕТИ- ОВАНИЯХ Изобретение может быть использовано для получения полинуклеотидов и зондов, которые могут найти применение в спорах и ри установлении отцовства или в судебной медицине, или с целью предотвращения, диагностики и лечения гейетических расстройств или предрасположенностей.Описаны различные ДНК-последовательности, которые могут быть использованы в качестве зондов для "полиморфизма человеческого и животного гономов,Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что могут быть получены полинуклеотиды и полинуклеотидные зонды, каждый из которых является специфическим для одного единственного информативного генетического участка.До настоящего времени было известно весьма ограниченное число гипервариабельных областей в человеческой ДНК, к ним относятся минисателлиты: 5 ген инсулина, 3-ген с-Нааз, ген коллагена типа и между генами глобина у 2 и фу 1, а также Ы 1788970 А(57) Использование: спор об отцов дебная медицина, диагностика и генетических расстройств, а также и положенностей. Сущность изобр способ заключается в том, что осу ют гибридизационный анализ ге ДНК путем скрининга библиотеки фаге путем гибридизации с послед ностью 33,6 или 33,15 и отбор поз клонов с последующим выделени или части выставки. 1 з,п. ф-лы,участок О 14 Я 1, определенный безымянным клоном ДНК, полученным из теломерной области длинного плеча хромосомы 14. Это минисателлиты существенно отлйчаются друг от друга своей вариабельностью, которая заключена в одном случае только в 6 различных аллелях. обнаруженных в гипервариабельной области коллагена, а в других их число превышает 80, как, например, в случае области О 14 Я 1. Общее число гипервариабельных областей в человеческом геноме пока не известно, но вероятнее всего, оно большое, В действительности, человеческий геном может содержать по крайней мере 1500гипервариабельных, областей,Установлено, что можно клойировать ДНК-фрагмент, идентифицированный при помощи гибридизации фрагментов геномной ДНК с полинуклеотидным зондом, способным дифференцировать ДНК при помощи сравнения с более чем одной пол. иморфной минисателлитной областью ил19индивидов переваривают ферментом Н п 1 1, подвергали электрофорезу в 0,8 о -ном агарозном геле, гибридизуют по Саузерну сР-мечеными Яац ЗА-вставками из р Лц 3 (пример 1),Л МЯ 8 и Л МЯ 40, как это описано в пункте материалы и методы. Фильтры промывают в 0,1 х ЯЯС при температуре 65 ОС, а затем получают авторадиограмму в присутствии интенсифицирующего экрана в течение 1 дня или 1 недели, Л МЯ 8 и Л МЯ 40 обнаруживают один и тот же.гипервариабельный участок и дополнительные вариабельные ДНК-фрагменты.Оставшиеся рекомбинанты Л МЯ 1, 31, 32 и 43 получают из других участков, которые не включают ранее охарактеризованный р Л 9 3-участок (см. пример 1). Хотя ни один из этих Л МЯ-рекомбинантов не дает фингепринтов ДНК сложных вариабельных фрагментов, большинство Л МЯ-зондов еженедельно подвергают кроссгибридизации в дополнительные полиморфные ДНК-фрагменты, если авторадиограмму снимают более длительное время.Два Л МЯ-рекомбинанта, обнаруженные при помощи зонда 33,15, Л МЯ 3 и Л МЯ 30, не имеют специфичного участка в человеческой ДНК, гидролизованной Нп 11 или Яац ЗА как в присутствии человеческой конкурирующей ДНК, так и без нее.Таким образом, несмотря на известные ранее трудности при клонировании больших и нестабильных человеческих минисателлитов, заявитель смог показать, что по крайней мере некоторые из самых больших и наиболее вариабельных ДНК-фрагментов, обнаруженных в фингепринте ДНК, поддаются клонированию в бактериофаге Л при условии, что эти вставки стабилизированы при помощи переноса фага в культуру-хозяина гес ВС Е,соИ.Ь) Определение блоков повторяющейся последовательности клонированных мини- сателлитов.Случайные сегменты ДНК-вставки из каждого Л МЯ-рекомбинанта анализируют на состав последовательности с тем, чтобы определить, каждый ли клонированный гипервариабельный участок состоит из тандемно повторяющегося минисателлита, Показано, что все Л МЯ-клоны состоят главным образом из тандемных повторяющихся блоков, длина которых изменяется в области от 9 п.о. для Л МЯ 1 до 45 п.о, для Л МЯ 43.Случайные сегменты каждого клонированного минисателлита анализируют для того, чтобы определить согласованный повторяющийся блок. Переменные позиции в каждом типе согласованности указаны сле 20 25. чаще всего связана с этими большими и 30 35 5 10 15 40 45 50 55 20дующими символами: В, г= А или 6; У, У= С или Т; й, и = любое основание, Минисателлит в МЯ 8 состоит из двух перемежающихся между собой повторяющихся блоков длийой 29 и 30 пар оснований.Ни в одном минисателлите нет повторяющихся блоков, полностью однородных. Минисателлит Л МЯ ц состоит из перемешанных множеств в двух очень похожих, но различных повторяющихся блоков длиной 29 и 30 п.о. Концы минисателлитов в Л МЯ рекомбинантах до сих пор не определены,Таким образом изолированы пять новых гипервариабельных участков, каждый из которых состоит главным образом из тандем- но повторяющегося минисателлита. Повторяющиеся тандемом блоки из р Л 9 3, Л МЯ 1, Л МЯ 31 и Л МЯ 32 содержат последовательность ядра. Однако, копии последовательности ядра являются несовершенными и простые сравнения повторяющихся блоков этих минисателлитов очевидно не дают возможности определить новую последовательность ядра, которая сильно вариабельными участками. Напротив, представляется весьма правдоподобным, что с большими минисателлитами может быть связан широкий спектр производных ядра, Минисателлиты Л МЯ 8 и Л МЯ 43 содержат в высшей степени нестандартные версии последовательности ядра. При помощи простых сравнений Л МЯ 8, Л МЯ 43 и 33,6 нельзя четко представить новую специфичную последовательность, которая связана главным образом с этими тремя участками,с) Менделево наследование и вариабельность участков,Пять новых минисателлитов Л МЯ 1, 8, 31,32 и 43 содержат(каждый) единственный большой и вариабельный участок, Менделево наследование всех участков подтверждают при помощи анализа сегрегации в больших горизонтальных родословных с использованием СЕРН-программы, Пробы ДНК по 1 мкг из СЕРН-семейства 1423 обрабатывают ферментом А 1 ц 1, гибридизуют по Саузерну с Р-меченой Яац ЗА-вставкой3из ЛМЯ 31.Степень аллельной вариабельности для каждого зонда оценивают при помощи анализа частоты сочетания аллелей между случайно выбранными англичанами. Пробы по 1 мкг ДНК гидролизуют ферментом На 1 1, гибридизуют по Саузерну с Л МЯ 43, Все индивиды являются гетерозиготными, что указывает на то, что степень гетерозиготности в этом гипервариабельном участке до178897021 22статочно высока"(Н 0,86, р 0,95). Более Большинствоаллелей изЛМЯ 31 распределточная оценка гетерозиготности может быть но довольно равномерно на относительносделана при помощи сравнения аллелей в узкой области размером от 5,5 до 9,3 т,п,о.,каждом индивиде с аллелями у шести бли- в то время, как аллели из Л МЯ 1 варьируютжэйших "соседей" на авторадиограмме с 5 по размеру от 2 до 20 т.п.о. В некоторыхтем,чтобы оценить степень сочетания алле- случаях имеется очевидная неравномерлей между отдельными индивидами, У всех ность распределения аллелей по длине, вобследованных индивидов Я = 0,11, откуда частности, в Л МЯ 43.проявляются два пресредняя частота алл/еля дможет быть оцене- обладающих класса размеров аллелей 5-6на как д = 1 - (1-8) = 0,056, а гетерозигот т.п,о, и 8 - 14 т.п,оа в р Л д 3 проявляютсяность как (1 - д) = 940 . Она представляет три класса размеров 1,6-1,7, 2,8-3,6 и 5 - 15собой минимальную оценку гетерозиготно- т,п.о. Обнаруженные участки являются в высти в условиях ограниченного разрешения сшей степени вариабельными,а в действигелевого электрофореза, тель ности, Они я вля ются самы мисе участки оказались высоковариа вариабельными среди большей части полбельными с гетерозиготностью, изменяю- иморфных участков, выделенныхдо сих порщейся в области от 90 для Л МЯ 8 до 99 из ДНК человека.для Л МЯ 31 (см. таблицу 1), Степень вариа- П р и м е р 3, Чувствительность минисации длины аллелей в дальнейшем анализи- теллитных зондов,руют при помощисравнения сйектра 20 Авторадиографическийсигнал гибридиаллелей, обнаруженных в объединенных из зэции по Саузерну, полученный после гиб 15 и 150 индивидов. Пробы ДНК от одного ридизации в течение ночи, достаточноиндивида(а), из обьединейной пробы 15 ин- насыщен при концентрации ДНК зонда 0,1дивидов (Ь) и из обьединенной пробы 150 нг/мл, причем также сигналы могут "бытьчеловек (с) гидролизуют ферментами Ац 1 25 легко получены от 60 кг и даже меньшего(для МЯ 32) или Нп 11(для всехоставшихся количества человеческой геномной ДНК.зондов), проводят гибридизацию по Саузер- Аналогично, в зависимости от генотипа йсну с гипервариабельными зондами, Все ин- пытываемых индивидов, с использованиемдивиды были случайно выбранными этих зондов можно обнаружить 2 и меньжителями Северной Европы, Индивиды "а" 30 ше ДНК одного индивида.включают в объединенные "Ь", а всех инди- П роведен а нализ чувствительности спе-видов объединения Ь" включают в объеди- цифичных относительно определенной обнение "с". Можно заметить, что Л МЯ 43 ласти зондов и их применения с цельюобнаруживает вторую вариабельную об- проведения судебной экспертизы в двойласть, представленную короткими На 11-ал ном преступленииизнасилование/убийстлелями, отмеченными символом 0; в во, Подозреваемый 1 был обвинен вдальнейшем эту область более детально не убийстве У, но судебное расследование воизучали, всей очевидностью показало, что обе жерт,- Для слабо вэриабельного участка Л МЯ вы Х и У были убиты одним и тем же челове-8 имеется двапреобладающих аллеля дли ком. Выделяли и аналйзировэлй ДНКизной 5,3 и 7,2 т,п.о. плюс 7 аллелей с меньшей следующих судебных образцов: "а" - волосычастотой, обнаруженных в группе из 15 че- жертвы Х, взятые через два дня после убий-ловек.Тотфакт,чтоэтидва преобладающих ства, "Ь" - смесь спермы и влагалищнойаллеля не являются результатом ошибки жидкости, извлеченная из лобковых волоспри взятии пробы у этих 15 индивидов, под жертвы Х; "с" - свежая кровь подозреваемотверждается таким же преобладанием их в го,"б" - кровьизсердца,взятаячерезденьгруппе из 150 индивидов, Аналогично, Л МЯ после убийства у жертвы У; "е" - влагалищ 43 (гетерозиготность 94 о ) обнаруживает 7 ный мазок у жертвы У, содержащий сперму.основных аллелей, которые согласуются в кровь и влагалищную жидкость, М" - пятногруппах из 15 и 150 индивидов. Напротив, 50 на юбке жертвы У, содержащее сперму инаиболее вариабельные участки Л МЯ 1, 31 кровь, Пробы "а" и "Ь" хранили в сухом видеи 32, и р Л д 3, гетерозиготность которых, при температуре 4 С в течение 3 лет, пробыизменяется в области 97 - 99 , не обнару- "б" и "е" хранили при температуре 40 С вживают аллелей с значительной частотой течение 2 месяцев, а пробу "Г хранили впопуляции, которые сочетаются с равной 55 сухом видепри температуре 4 С в течениеинтенсивностью у обоих групп индивидов. 2 месяцев. ДНК извлекали, гидролизовалиРазброс длин аллелей у кавказцев тэк- Нп 1 1 и подвергали гибридизации по Сауже изменяется между такими гипервариа- зерну с меченой Р- Л МЯ 1-вставкой, ДНКнием проб "е" и Т. Авторадиограмму получали в течение одной недели в присутствии интенсифицирующего экрана. Пятна спермы "Ь", "е" и "Г содержат два гибридйэирующихся фрагмента ДНК, которые не могут принадлежать жертве. Кроме того, проба "Ь" содержала аллели жертвы, полученные из влагалищной ДНК. Аллели спермы "Ь", "е" и Т неразличимы, что наводит на на мысль, что жертвы Х и У были на самом деле изнасилованы одним и тем же мужчиной. Аллели подозреваемогоне сочетались с аллелями пятен спермы.Эти результаты подтверждали припомощи гибридизации с АМЯ 31 и при помощи анализа фигнепринтов ДНК более значительных количеств судебных материалов. В свете этих данных, обвинения выдвинутые против подозреваемого, были сняты прокурором,П риме р 4,Объединенные минисателлитные зонды,Чувствительность минисателлитов в процессах гибридизации по Саузерну позволяет объединить зонды с тем, чтобы их использовать с целью обнаружения вариабельных фрагментов из нескольких участков одновременно, как это было сделано для объединения из 5 зондов (р А 9 3, 1 МЯ 1, 1 МЯ 8, А МЯ 31 и А МЯ 43), Теоретически количество фрагментов ДНК, которое можно обнаружить при помощи 5 зондов, равно(1+ Н;), где Н; - гетерозиготность 1-го зонда, Для этих 5 зондов в среднем может быть обнаружено 9,78 фрагментов на один индивид, На практике может быть разрешено 8,4+ 1,2 (ст. отклонение) полос2 т,п.о, (испытано 40 случайно выбранных индивидов). Такая потеря разрешаемых полос частично объясняется исключением малых (1,6 т.п.о.) и относительно распространенных р А 9 3 аллелей (пример 1, средняя потеря на одного индивида = 0,33 полосы), но в основном это результат совместной миграции при электрофорезе различных минисателлитных аллелей.Структуры пятен дот-гибридизации с несколькими участками дают высокую индивидуальную специфичность только с 18; (ср. отклонение+ 110) ДН К-фрагментов, которые сочетаются у пар, случайно выбранных жителей Северной Европы (испытано 40 пар.).10 15 20 25 или О, А может присутствовать или отсутст 30 35 55 40 45 50 У троих отец/мать/ребенок все фрагменты потомства можно проследить. Каждый потомок содержит 3,4+0,5 ДНК-фрагментов, которые носят специфичное отцовское происхождение и равное количество специфичных для матери ДНК-фрагментов (испытано 10 троек отец/мать/ребенок).Формула изобретения 1, Способ получения полинуклеотида для использования в генетических исследованиях, предусматривающий гибридизационный анализ геномной ДНК, который включает окрининг библиотеки ДНК в фаге путем гибридизации с пробой, и отбор позитивных клонов с последующим выделением всей или части вставки, о т л и ч а ю щ и йся тем, что, с целью повышения специфичности полинуклеотида, в качестве пробы используют последовательность 33,6 или 33,15, содержащую по меньшей мере 3 тандемных повтора, включая комплементарные последовательности; (А) АОООСТООАОО, где Т представляет собой Т вовать, или АОА ООТОООСАООТОО, где Т представляет собой Т или О, причем она в среднем имеет по меньшей мере 70% гомологии между всеми тандемно повторяющимися последовательностями и выявляют полинуклеотид, способный гибридизироваться с ДНК-фрагментом, содержащим минисателлит, специфический к конкретному участку или локусу генома, при этом указанный участок имеет аллельную вариацию по меньшей мере 3 (100).2, Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что минисателлит содержит любую одну последовательность, выбранную из:(где У обозначает С, Т или О, Х обозначает6 или С, й обозначает А или 6 и Т обозначаетТ или 0), или ее тандемную дупликацию26 1788970 15 20 25 30 35 40 45 50 Составитель Н.КузенковаТехред М.Моргентэл Корректор О.Юрковецкая Редактор Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 Заказ 83 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5гипервариабельным участком, например, с Оетго 1 с 55,1,: СС 110,использованием зондов 33,6 и 33,15, кото- ВРМ 6666,:,. СС(. 1 1 3рые были предложены и описаны в вйше- ВРМ 7666СС 114упомянутой заявсе,", и получить из. него": ССРА-СЕМ СС 119полинуклеотид или зонд, способный к гиб ССВР-ЯВ СС 1 120ридизации с ДНК-фрагментом, который со- НТСС 121держит минисателлит, который является "НОСС 122специфичным относительно определенной СНРЗ (М,Ю) СС 1 132области или участка на геноме; вышеупомя 47(МаОо) СС 1 135нутая область или участок и представляет 10 НЕ 299 СС 1 137собой информативный генетический уча 24 СС 151сток. В настоящем изобретенйииспользо-, НЕ 1,: " . ",СС 1 153вэн информативный генетический учась ок " МСС 1 154как участок, в котором можно выявить по МЯССС 1. 171крайней мере 3 различных аллеля в любой 15 МАЙСС 1 186пробе из 100 случайно выбранных индиви-18 174 Т " СС 188дов, Этот фактзаключается в том, что уча-1.186( еаза) СС 190сток (область) имеет аллельную вариацию 1 97 А (АМу) СС 1 191не менее 3. Существенным здесь является Н Р-э СС 199то, что проба из 100, 500 или 1000 индивидов 20 ССОо СС 200действительно, подбирается случаййо,"такССОц СС 1 201как обычно вполне возможно идейтифици-ССОЬ СС 1 202ровать 100, 500 или 1000 йндивидов кото- "ССОВг СС 203рые имеют менее 3 аллелей в данной ССОц СС 204информативной генетической областй йри 25. ССОо СС 1 205помощи просеивания.достаточно большогоССО.о СС 210количества членов общей популяции; " Приведенные выше линии клеток можЧем выше этот полиморфизм вданной но получить из АТСС, 12301 Пакла наклаунинформативной генетической области, тем Драйв, Роквилл, Мерилэнд 20852-1776,более эффективным и информативным бу США, а их список имеется в каталоге АТССдет специфический зонд для этой области линийклеток и гибридов. Все вышеупомяпри идентификациииндивидасцельюуста- нутые линии клеток сданы на хранение вновления отцовства или судебной эксперти- АТСС по 1985 г,зы.(относительно применений к человеку 35 Таким образом, настоящее изобретенастоящего изобретения выражение "ин- ние использует минисателлит, который явформативный генетический участок", как ляется специфическим относительнооно здесь используется, может быть опреде-определенной области или участка в геноме,лено как область, в которой можно разли- "имееталлельную вариацию, равную не мечить по крайней мере 3 аллеля в ДНК, 40 нееЗ. Изобретение включает клонированиеэкстрагированной,из любых 20 линий кле-фрагмента ДНК, идентифицированного при., ток из списка, йриведенного ниже. Эти лй-помощи гибридизации фрагментов геном- нии клеток сданы на хранение в нойДНКсполинуклеотиднымзондом, котоАмерикэнское.собрание типов кулЬтур рый способен дифференцировать ДНК по( СС):,45 болеечем одной полиморфной минисател (АТСС):ЛИНИЯ . НОМЕР литной области или гипервариабельномуКЛЕТОК, . КУЛЬТУРЫучастку и получение из него полинуклеоВ АТСС"" тида, способного к гибридизации с фрагНеа . СС 12 " "ментом" ДН К, который содержитВРМ 12650,СС 1 3050 минисателлит, специфический относиОе 1 гот 532 СС 1. 54 "" " тельноопределенной области или участкаОесгот 525 . СС 65" " в геноме, и имеет аллельную вариацию,Ое 1 го 1529 СС 66 "равйуюне менее 3 (100)Оетгос 510 . СС 1 72". Полинуклеотидный зонд содержит наИ 1-38- 8 ., СС 75 " " 55 рядусмеченой компонентой или компоненС 1 сгчШпепа .: ., СС 1. 76 " . "-той-марквром полинуклеотид содержажащии - "-3 ., СС 85 "по крайней мере три тандемных повтора "ВА 31 СС 1 83(при пб крайней, мере 7000 гомологии) поОЛстепени, которая позволяет осуществить гибридизацию зонда с соответствующим фрагментом ДНК, полученным при помощи расщепления пробы ДНКэндонуклеазой рестрикции.Каждый повтор содержит ядро, которое имеет по крайней мере 70% гомологичность с минисателлитной ДНК из различных геномных участков, ядро имеет длину от б до 16 нуклеотидов, общее число нуклеотидов внутри повторяющего блока, которые не участвуют в формировании ядра, не превышает 15,В предпочтительном варианте вышеупомянутый ДНК-фрагмент содержит мини- сателлит из минисателлитной области или гипервариабельного участка, который может быть обнаружен при помощи полинуклеотидного зонда, содержащего по крайней мере три тандемных повтора последовательности, комплементарной последовательности:(А) А 666 СТ 66 А 66(1) (в которой Т является Т или О, а (А) может как присутствовать, так и отсутствовать) или последовательности, комплементарной последовательности:А 6 А 66 Т 666 СА 66 Т 66 (2) (в которой Т является Т или О),Рассматривается также нуклеотидная последовательность с ДНК-фрагментом, полученным в результате расщепления геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции, причем вышеупомянутый фрагмент ДН К содержит минисателлит из вышеупомянутой минисателлитной области или гипервариабельного участка.отличающийся тем, что:1) вышеупомянутая область или участок имеют аллельную вариацию (как она была определена выше), равную по крайней мере 3 (100), и2) вышеупомянутая область или участок могут быть обнаружены при помощи полинуклеотидного зонда, содержащего по крайней мере три тандемных повтора последовательности (включая также комплементарн ые последовательности):(А) А 6 6 6 6 СТ 6 6 А 6 6 (1) (где Т обозначает Т или О, а (А) может как присутствовать, так и отсутствовать) или последовательности (включая комплементарные последовательности);А 6 А 6 6 Т 66 6 СА 6 6 Т 66 (2), где Т - Т или О.В изобретении используются следующие термины.Гипервариабельность.Область человеческой, животной или растительной ДНК называется гипервариа 5 10 А 66 ААТА 6 ААА 66 С 666 У 66 Т 6 Т 666 ССА 66 6 А 6 Р 66 С 3 6 Т 66 АУА 66 4 Т 666 А 66 Т 66 ВУА 6 Т 6 ТСТ 6 5 55 6 ААТ 66 АОСА 66 У 6 ВССА 6666 Т 6 АСТСА 6 666 СТ 6666 А 6 АТ 66 Т 66 А 66 А 66 Т 6 ТТ 6615 20 25 30 35 40 45 50 бельной, если она может находиться в многочисленных формах, например, в том, что касается длины или порядка.Минисателлит,Область человеческой, животной или растительной ДНК, которая составлена из тандемных повторов короткой ДНК-последовательности, Все повторяющиеся блоки не обязательно должны обладать совершенной идентичностью. Полиморфизм.Если ген или любой фрагмент ДНК обладает изменчивостью от одного индивида к другому или между данными спаренными хромосомами индивидов, то говорят, что он полиморфный,Тандемная последовательность.Это полинуклеотидная последовательность, которая точно или с некоторыми изменениями повторена в ряд. В общем случае, последовательность называется состоящей из тандемных повторов, если такой повтор содержится по крайней мере три раза,% гомологичности,При сравнении двух повторяющихся или тандемных повторяющихся последовательностей А и В гомологичность в процентах выражается числом пар оснований в А, которое меньше числа вставок, замещений или удалений пар оснований в В, которое необходимо было бы осуществить для того, чтобы получить А, выраженное в процентах. Таким образом, гомологичность в процентах между двумя последовательностями АТОС и А 6 С равна 75 ф .Согласованное ядро (последовательность).Последовательность, которая может быть идентифицирована как ближайшая пара среди нескольких повторяющихся последовательностей; в общей случае среди повторяющихся блоков двух или более различных минисателлитов.Полинуклеотиды, относящиеся к настоящему изобретению, могут быть идентифицированы при помощи полинуклеотидного зонда, содержащего любую одну последовательность, выбранную из следующих последовательностей: А 66 СТ 6666 А 6 АТ 66 Т 66 А 66 АА 6 А 6 ТАС 8Т 6 Т 6 Т 6 ТААТ 666 ТАТА 66 СА 666 СССС 66(АА 66666 ТСТ 66 УХ 9(в которых У является С, Т или О, Х является0 или С, й является А или 6, а Т является Тили О) или их тандемных повторов," или 6 оследовательностей, комплементарных кним,В общем случае, полинуклеотиды и зоны специфичны относительноопределенного участка при очень строгих условияхгибридизации, В этом отношении выражение "специфичный" относительно определенного участка используется в-связи сполинуклеотидом или зондом с тем, чтобыпоказать, что полинуклеотид или зонд можно использоватьпри условиях гибридизации, которые" гарантируют, чтополинуклеотид или зонд гибридизируетсятолько с одним единственным специфичным участком,Однако, необходимо иметь в виду, чтозонды, специфичные относительно определенного участка, если их используютприменее строгих условиях гибридизации, способны дифференцировать ДНК при помощисравнения с более чем одной полиморфнойминисателлитной областью или гипервариабельным участком и, таким образом, ихможно использовать для идентификациидругих информативных генетических участков.. Повторы; которые не являются точными, именуются в соответствующих местахкак несовершенные повторы, Такие повторы, тем неменее, могут быть "узнаны" какточные повторы, В общем случае, это будетозначать,что ймеется в среднем по кРайнеймере 700 гомологичность между всеми повторяющимися блоками, В предпочтительном варианте существуетпо крайней мере800 , в более предпочтительном вариантепо крайней мере 850 , особенно предпочтительном - 900 гомолотичнбсть между всемиповторяющимися блоками, Необходимоиметь в виду, однако, чтонеуклеотидная последовательность или "повторяющийсяблок" не обязательно повторяется целиком,если это необходимо,Число повторяющихся блоков в предпочтительном варианте должно быть не ме-нее 5, в еще более предпочтйтельномварианте неменее 10, В общем случае, изменяется в области от 10 до 40, но, в прин-ципе, может быть" произвольным чйслом,"даже в области 1 - 10000.В предпочтительномварианте полинуклеотиды и полйнуклеотидные зонды содержат любую последовательность, выбраннуюиз формул с 3 по 9, приведенных выше.Изобретение позволяет идентифицировать информатйвную генетическую областьв человеческомгеноме и йриэтом" позволяетполучить зонды, специфические относительно ой ределенн ых областей, причемкаждый зонд, специфичный, относительно определенной информативной геномной 5 области. Была осуществлена, в частности,идентификация шести различных информативных генетических участков, причем эти участки обладают очень высокой гетерозиготйбСтью в испытываемой популяции (не 10 мейее 900 ) и онинаходятся среди наиболеепблиморфных йз изолйровайных до сих пор, Заявитель получил специфйческий относительно определенной области зонд для каждой области, эти зонды были обозначе ны рЛ 9 Х,ЛМЯ 1,ЛМ 38,ЛМЯ 31,ЛМ 332 иЛ М 343 (они"соответствуют определенным выше зондам)Степень индивидуальности генотипов,определенных при помощи, специфичности 20 относительнообласти зондов, может бытьоценена из гетерозиготности (Н) в каждой области, Средняяаллельная частота р в некотором участке задается при помощи(1-Н).а вероятность того, что два случайно вы бранйых индивиуа включают один и тот жегенотип; равна р (2 - р). Эта вероятность необоснованного связывания двух индивидов изменяется от 0,02 для Л МЯ 8 до 0,0002 для Л МЯ 31, причем эта оценка является консер вативной в том смысле, что неоднородностьпо р снижает эти вероятности, Вероятность необоснованного связывания для всех шестй мйнисателлитных зондов равна прибли - 16зительно 10, что сравнимо с 35 вероятностью того, что два случайно выбранных фингепринта ДНК, обнарукенных при помощи одного зонда, специфичного относительно нескольких областей, идентичны (см. патент Великобритании % 40 2166445). Напротив, вероятность того, чтодве области идентичны для данного гипервариабельного участка, задается формулой 1/4 (1+ р) . Вероятность идентичности для всех шести зондов равна 0,0004 по 45 сравнению с примерно 10-7 для фингепринта ДНК с использованием одного зонда, специфичного относительно, нескольких"областей.Эти структуры обеспечивают высокую 50 степень индивидуальной специфичности, ."хотя она не столь высока по сравнейию стой,которую можно по 11 учить при использовании зондов относительно нескольких областей или при использовании последо вательной гибридизации с зондами, специфичными относительно определенной области (см, выше). Оба типа зондов, объе-,диненные зонды или отдельные зонды, специфичные относительно определеннойобласти, могут оказаться особенно эффективными при изучении клеточных химер.В приводимых ниже примерах используемые зонды 33,6 и 33,15 описаны в патентной публикации Великобрита н ии М 2166445, Они содержат повторяющуюся последовательность:(А) А О О О СТ О О А О О иА О А О О Т О О О С А О О Т О О соответственно. 10П р и м е р 1, ДНК выделяют из белых кровяных клеток и из трансформированной вирусом Энстейна-Барра линии клеток лимфобластов. Осуществляют переваривание рестриктазами. Фрагменты двунитевой 15 ДНК зондов изолируют при помощи электрофореза на бумаге ДЕ 81, а затем снабжают Р-меткой при помощи любой олигонуклеотидной затравки, Однонитевой минисателлитный зонд 33,15 получают в со ответствии с описанием, данным Джеффрисом и др. (1985), Магоге, 314, стр. 67-73. Клонирующий гипервариабельныйфрагмент. 25600 мкг ДНК линии клеток лимфобластов, обработаной ферментом Яац ЗА, фракционируют при помощи электрофорезэ в0,500-ном агарозном геле и фракции соответствующих размеров собирают с использованием электроэлюирования нэмембрану для диализа, После двух цикловпрепаративного гелевого электрофорезафрагмент д подвергают 1000-кратной очистке (выход 150 нг ДНК) 20 нг этой очищенной 35фракции подвергают лигированию с 60 нгДНК Ъ 47.1, выделенной после расщепления ферментом Ваш Н 1, упаковывают в лабораторных условиях и помещают напластинки с культурой Е,со 1 ЮЬ 95/803, звр 40Е, зор Р, 1.зб Як, Ьзб Мк, топ А, 1 грй, тетейлизогенные для Р 2 с тем, чтобы отобратьрекомбинанты; Полученную в результатебиблиотеку рекомбинатного фага 1500 просеивают при помощи гибридизации на плэстинке с минисателлитным зондом 33,15.Четыре положительные пластинки сновараспределяют по пластинкам и отбирают накультуре Е.со ЕД 8910(803, зор Е, зцр Р, гесВ 21, гез С 22, ЯЯбЯ) и ДНК рекомбинантного50фага выделяют. Яац ЗА-вставку рекомбинантного фага дЗ субклонируют по сайту ВавН в плазмиду р. С 13 и культивируют в гезА-производной культуре Е.со. М 83,М 83,Л (гез А-зг 1 Р) 306:Тп 10, 55Анализ ДН К-последовательности,ДНК- рАд 3 обрабатывают ультразвуком, отбирают по размеру и клонируют всайт Яща 1 ДНК М 13 щр 19, Чтобы определить ДНК-последовательности области из тандемных повторов в рАд 3, анализируют последовательность у 12 случайных клонов при помощи процедуры анализа концов ДНК. 8 из этих клонов получают из минисателлитной области тандемных повторов в рЛц 3 и используют для определения согласованной повторяющейся последовательности. Клоны М 13, содержащие области с 5- и 3-концами, обнаруживают при помощи гибридизации с Р-мечеными зондами А и В (см. черт.1, описанный ниже) и анализируют последовательность с тем, чтобы оп ределить последовательность боковых областей, а также начальные и концевые пункты мини- сателлита.Результаты,Изоляция специфичного минисателлитэ.Индивид 119 из родословной Гуджарати, описанный Джеффрисом и др. (1986) Ат. ,). Нов. Оепет, 39. стр,11-24) подвергают анализу на (СНПГП) сохранение наследственных признаков гемоглобина плода и ее фингепринт ДНК, обнаруженный после обработки Яао ЗА при помощи минисателлитного зонда 33,15, содержит полиморфный фрагмент в 8,2 т.п.о. (тысяч пар оснований) (фрагмент "д"; черт,1 а), который имеет тенденцию образовывать сочетания с СНПГП у других членов этого рода. Этот ДНК-фрагмент подвергают очистке от других минисэтеллитных фрагментов с использованием двух циклов препаративного гелевого электрофореза. ДНК из индивида 19 переваривают ферментом Яао ЗА, а фрагменты длиной 6 - 9 т,п.о, собирают при помощи препаративного электрофореза. Эти фрагменты снова подвергают электрофрезу. Отдельные порции ДНК 111 9 обрабатывают ферментом Яаи ЗА, каждую фракцию подвергают электрофорезу в 0,8-ном агарозном геле и проводят дотгибридизацию с минисателлитным зондом 33,15, Фрагмент ц (8,2 т,п.о,), который гибридизуется с СНППГ, подвергают примерно 1000-кратной очистке во фракцию 3.Фрагмент "ц", обнаруженный в продукте обработки ферментом Яао ЗА и подвергнутый очистке приблизительно в 1 ЬОО раз, клонируют в А 47,1 и затем переносят на Р 2-лизогенную гес + культуру Е,со с тем, чтобы отобрать рекомбинатный фаг, Полученную в результате библиотеку просеивают при помощи гибридизации с зондом 33,15. При этом получают четыре положительных бляшки. Их снова помещают нэ пластины (О - 8 риац (бляшку) (С гес В, гес С культурой Е.со 1) с тем, чтобы получитьбляшки нормального размера (1 мм в диаметре), Далее два клона Лд 1 и Лд 3 анализируют и обнаруживают, что они содержат Яац ЗА-вставки размерами 7,7 и 7,8 т,п,о. соответственно, Оба эти клона получают из полосы с 3, но они короче полосы д на 0,5 и 0,4, т.п.о. соответственно, Так как не было какой-либо неоднородности в размерах Яац ЗА-вставки как в клоне Лд 1, так и клонеЛд 3, выращенных на гез В, гез С культуре Е.со (эти данные здесь не приведены), отсюда следует, что часть вставки была "утеряна" в каждом клоне в процессе их первоначального переноса на гес+ культуру Е,со 11.Выходы ДНКЛд 1 и Лд 3 были очень низкими (100 от выхода рекомбинатной ДНКЛ 1 47,1), что указывает на необычные свойства роста таких минисателлитных клонов, Поэтому Яац ЗА-вставку субклонируют в Р 33 С 13 и переносят в гес А-производную культуры Е,со 3 3 М 83. Полученный в результате субклон, р Л д 3 содержит Яац ЗА-вставку в 7,1 т,п.о., что на 0,7 т.п,о. короче, по сравнению с вставкой в дЗ.Организация минисателлитного фрагмента д,Структуру минисателлитного фрагмента в рЛ 9 3 определяют при помощи рестрикции и анализа ДНК-последовательности,Карта для Яац ЗА-вставки в р Л д 3 построена при помощи эндонуклеазы сечения А 3 ц 1(А), Ос 3 е 1(1), Нае 11(Н), МЬ 11(М), Рзт (Р) и Яац ЗА(Я), Сайты сечения для Н 3 п 11 или РЯ а 1 отсутствуют, Вставка в 7,14 т.п.о, содержит 171 тендемный повтор последовательностии в 37 п.о. (пар оснований) плюс 747 п.о. боковых для ДНК,ДН К - последовательность гипервариабельного фрагмента д содержит область с 5 и,З конец и минисателлит вместе с повторяющимися последовательностями трех случайных областей (а - с) из этого минисателлитэ, начало" обращенного А 1 ц-фрагмента, несколько простых областей последовательности в 5 - области, согласованную последовательность (соп) минисателлитного повторяющегося блока в 37 п.о, второй повторяющийся блок в области "с" содержит сайт рестрикции Нае 111, и эта область образует внутренний сайт Нае 111 в минисателлите.Клон р Л д 3 содержит минисателлит в 6,3 т,п.о., лишенный сайтов рестрикции, за исключением единственного внутреннего сайта Нае 111, Этот минисателлит составлен из 171 повтора блока в 37 п,окоторый содержит последовательность 6 Т 6 6 6 С А 6 6, Эта последовательность в точности соответствует наиболее инвариантной час 5 10 15 20 25 плотностью сайтов рестрикции. Начало 5 -30 35 40 45 50 55 ти последовательности ядра в 11 - 16 п.о., которая ранее былаидентифицирована как сочетающаяся с несколькими различными человеческими минисателлитами. Повторяющиеся блоки не являются полностью однородными. Анализ последовательности нескольких случайно выбранных областей внутри этого минисателлита выявляет ограниченное количество измененийповторя ющейся последовательности, Большинство вариантов, включающих делецию в 4 п.о который продуцирует под множество повторяющихся блоков в 33 п,ораспространены по более чем одному повторяющемуся блоку. Один вариант(трансверсия АС в области С) создает единственн ы й внутрен ний сайт Нае 111 и он является единственным, обнаруженным в одном повторяющемся блоке. Начал ьн ые и кон цевые повторя ющиеся блоки минисателлита больше отличаются последовательностями, чем внутренние повторы,Минисателлит в р Л д 3 содержит боковую не повторяющуюся ДНК с нормальной области состоит из головной части обращенного А 1 ц-элемента. Оставшиеся 5- и 3- области, определенные с использованием зондов гибридизации а и Ь, являются уникальной последовательностью ДНК и гибридизация осуществляется только на этом участке ДНК(эти данные не приведены). 5 - область содержит значительное количество ДНК с простой последовательностью (полипурин и (АСС)п),Минисателлитный фрагмент д обнаруживает единственный полиморфный участок.Для того, чтобы определить, можно ли использовать полный клонированный минисателлитный фрагмент в качестве зонда гибридизации для специфического обнаружения соответствующего участка в человеческой ДНК Яэц ЗА-встэвку из р Л д 3 подвергают гибридизации в присутствии конкурентной ДНК человека, обработанной ферментом Н 3 пГ 1.При помощи р Л д 3 обнаружено Менделево наследование полиморфных ДНК- фрагментов. 8 мкг человеческой ДНК обрабатывают ферментом Н 3 п 11, подвергают электрофорезу в 0,80 -ном агарозном геле, гибридизуют с Яац ЗА-вставкой из р Л д 3 в 1 х ЯЯС при температуре 65 С в присутствии ба-ного раствора полиэтиленгликоля и 50 мкг/мл конкурентной ДНК плаценты человека после гидродинамического фрагментирования с иСпользованием щелочи, и промывают в 0,2 х ЯЯС при температуре65 С. При помощи р А д 3 обнаруживают единственный участок, который является гетерозиготным во всех" указанных индивидах. Наследование аллелей является менделевым,10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 П ри весьма строгих условиях (0,2 х ЯЯС, 65 С) обнаруживают либо один, либо два прогибридизировавшихся фрагмента во всех проверенныхиндйвидах. При помощи р, д 3 обнаруживают фрагмент д в 8,2 т.п,о, в ранее обследованных родственных индивйдах8, что подтверждает клонирование полосы д. При менее строгих условиях (1 х ЯЯС, 65 С) обнаруживают дополнительный, слабо гибридизующийся, полиморфный ДНК-фрагмент, ДНК-фрагменты, обйаруженные при помощи р А д 3 и ри очен ь строгих условиях, класс ифи цированы как аллели одной области. Этот участок не связан с полом и, как было установлено, не является существенным, но половые связи в двух больших родословных были исследованы не полностью (исследовали 61 потомка, 2 = 0,18 при д = 0,43; эти данные не приведены). Он ведет себя как аутосомная-область и расположен на 7 хромосоме.Полиморфное изменение в минисателлитном участке.Продукты обработки ферментом Нп 1ДНК из 79 случайно выбранных британцев кавказского происхождения отбирают при помощи вставки из р А д 3, сначала отдельно, а затем в группах по 14 человек (1 мкг ДНК от индивида), подвергают электрофорезу в 0,7 оь-ном агарозном геле длиной 35 см с тем, чтобы получить максимум аллельного разрешения. Длину минисателлита в самом коротком типичном аллеле определяют при помощи геномной карты этого фрагмента в гамозиготе, используя боковые зонды а и Ь одной копии,Количество повторов на аллель очень приблизительное и зависит от пропорции в минисателлите повторяющихся блоков в 37 - 38 п.о. За исключением короткого типичного аллеля, оставшиеся аллели попадают в выборку либо однажды (42 аллеля), либо дважды (12 аллелей), либо три раза (12 аллелей), либо четыре раза (5 аллелей). Такое распределение не очень сильно отличается от ожидаемого, если все эти аллели встречаются редко (д = 0,0081, 2 (4 ф, р.) = 4,0) и оно, следовательно,согласубтся с простой моделью одного типичного корОткого аллеля (д= 0,165), причем в этой популяции одинаково редко присутствуют 103 аллеля (д= 0,0081 на аллель),По крайней мере 77 различных аллелей могут быть "разрешены" в этой популяционной пробе, причем количества повторов изменяются в области от 14 до примерно 525 на аллель, Гомозиготы в этой популяционной пробе все гомозиготны с самым коротким аллелем. Приведенные оценки для числа аллелей и средней частоты для редких аллелей ограничиваются разрешением гелевого электрофореза и реальные числа для аллелей различной длины в этой пробе могут быть больше.Распределение длин аилелей не совсем произвольно, а содержит "трикласса аллелей с коротких (14 - 16 повторов), средних (41 - 68 повторов) и длинных (107 - 424 повтора). Бимодальное распределение длин аллелей было ранее отмечено"для кавказцев в гипервариабельной области, расположенной от 5 до гена человеческого инсулина (Матцге, 1982, 295, стр. 31 - 35), хотя такая бимодальность не очевидна для негрев.Изоляция фрагмента д подтверждает, что бол ьшие и вы со ко пол иморн ые Д Н К- фрагменты в фингепринте ДНК могут быть клонированы с тем, чтобы получить специфичные относительно определенной области зонды, пригодные для изучения отдельных гипервариабельных областей. Несмотря на то, что фрагмент д можноклонировать в бактериофагЛ, полученные в результате клоны проявляют необычные свойства роста на гес культуре Е,со. Это может приводить к изъятию минисателлитных клонов из известных амплифицированных человеческих библиотек в фаге, Клонированный минисателлит не стабилен как относительно внешних, так и внутренних возмущений при субклонировании в рО С 13 в гес А культуре Е,со. Рекомбинантный р А д 3 теряет примерно 30 повторяющихся блоков по сравнению с фрагментом р А д 3, следовательно, не полностьюотражает организацию фрагмента д.Клонированный ДНК-фрагмент имеет ожидавшуюся структуру для минисателлита, что подтверждает тот факт, что фрагмент д не был получен из ДНК с более длинным сателлитом, Несмотря на присутствие как последовательности "ядра" в каждом повторяющемся блоке, так и части Ац - последовательности в 5 -области, клонированный фрагментд в присутствии конкуретной человеческой ДНК действует как специфичный относительно определенной области зонд. Неудача при использовании р А д 3 с целью эффективного обнаружения других, содержащих ядро, минисателлитов, объясняется15 10 15 20 25 ка 30 35 40 45 50 55 присутствием дополнительной неядерной ДНК в каждом повторяющемся блоке.Клонированный минисателлит проявляет полиморфизм по длине, что вероятно объясняется аллельной вариацией как в количестве повторяющихся блоков, так и в отношении повторяющихся типов с длиной 37 и 33 п,о, в каждом аллеле, В каждой случайной популяционной пробе из 158 хромосом можно обнаружить один распространенный и по крайней мере 76 редких аллелей, Этот участок является гораздо более полиморфным, чем большая часть, или даже все клонированные человеческие гипервариабельные области, которые охарактеризованы до настоящего времени, включая селекцию относительно коротких клонированных минисателлитов,Гетерозиготность в этом участке составляет не менее 96,8 О, причем большая часть гомозигот рождается из короткого распространенного аллеля,Новые аллели на этом участке возникают либо в результате изменения количества повторов, либо за счет сдвига рамки в процессе репликации ДНК, либо за счет неравного обмена. Предполокив наличие случайного дрейфа мутации, вычисляют параметр 4 ЙеЧ ( 0), где Ке - эффективный размер популяции, а Ч - скорость мутации на одну гамету, исходя из количества различных аллелей, отмеченных в популяционной пробе. Заявитель рассчитывает, что он содержится в диапазоне 60 - 90 для этого участка, в зависимости от того, включал или не включал распространенный короткий аллель, Так как Ке для человека равен примерно 10, скорость мутации Ч в аллели новой длины в этом участке равна приблизительно 0,002 на одну гамету. Это значение для Ч занижено, так как количество обнаруженных аллелей лимитируется разрешением гелевого Электрофореза и так как не существует бесконечного числа потенциальныхх разрешаемых аллелей. Средняя длина ДНК минисателлита на этом участке составляет 5 т.п,о, и, следовательно, скорость мутации (рекомбинации) на 1 т.п.о. минисателлита составляет4 х 10 по сравнению с 10 на 1 т.п.о.,установленную для других, содержащих более короткое ядро, минисателлитов и среднЕй скоростью мейотической рекомбинации 10 на 1 т.п.о. для человеческой ДНК (Ка 1 цге, 1985, 314, стр,67-73), Таким образом, скорость образования новых аллелей в этом участке мини- сателлита гораздо более высокая, По-видимому, скорость мутации для коротких аллелей является относительно небольшой, что может служить объяснением того,как самый короткий аллель мог дрейфовать, чтобы обеспечить значительную частоту в популяции, не подвергаясь разрушению в результате неравных обменов в течение этого процесса.Способ фингепринта ДНК представляет собой эффективное средство для индивидуальной идентификации и для установления семейного родства, например, в спорах об отцовстве и иммиграции, Точность этого способа определяется низкой средней вероятностью того, что некоторая полоса имеется у двух случайно выбранных индивидов, Для британцев кавказского происхождения величина Х была оценена как 0,2 для Нгпе 1-фрагментов фингепринта ДНК, с длиной более 4 т.п,о. В тех случаях, когда полоса встречается у нескольких индивидов (то есть, когда полоса одного индивида сочетается у второго индивида с полосой той же подвижности и авторадиограммой интенсивности), то не ясно, представляют ли сочетающиеся полосы идентичные аллели одного и того же минисателлитного участИспользуя зонды 33,6 и 33,15 фингепринта ДНК, можно заметить расщепление до 34 диспергированных аутосомных участков у больших групп людей, состоящих из братьев и сестер. Для большей части проанализированных участков только один из двух аллелей был отмечен во всей совокупности разрешенных фрагментов фингепринта ДНК значительных размеров ( 4 т.п,о,), что наводит на мысль, что существуют большие различия по размерам между минисателлитными аллелями, причем много аллелей расположено в плохо разрешаемой ( 4 т.п,о,) области фингепринта ДНК, Это также можно заметить для клонированного минисателлита; Нп 11-аллели на этом участке варьируются по длине от 1,7 до 20,4 т,п.о., а распределение частот аллелей показывает, что оба аллеля из этого участка могут быть разрешены в фингепринте ДНК только для 40 О индивидов в то время, как ни один из аллелей не обнаружен у 14 О человек.При помощи минисателлитных зондов 33,6 и 33,15 обнаружены примерно 60 гипервариабельных участков,В приводимом ниже примере 2 используют следующие материалы и приемы,а) Клонирование селекции больших минисателлитов.Собирали 5 мг ДНК крови от каждого из 40 случайно выбранных индивидов, гидролизуют ферментом Бац 3 А, а фрагменты в 5 - 15 т.п.о, изолируют при помощи препаративного электрофореза в 0,6-ном агарозном геле с последующим электроэлюированием на мембрану для диализа. Очищенную фракцию подвергают электрофорезу во втором препаративном геле с тем, чтобы удалить все СЛеды загрязняющих небольших Яаи ЗА-фрагментов. 50 нг фракции в 5 - 15 т,п.о. лйгируют с 100 нг 147,1 - ДНК, полученной после расщепления ферментов Вагп Н 1(Оепе, 1980, 20, стр.249 - 259), упаковывают в лабораторных условиях, создают библиотеку и отбирают с использованием человеческих минисателлитных зондов 33,6 и 33,15. Положительные бляшки изолируют в соответствии с описанием, приведенным в примере 1, с тем, чтобы получить 1 С-серии рекомбинантного фага.Ь) Изоляция минисателлитных зондов гибридизации.ДНК рекомбинатного фага переваривают ферментом Яэо ЗА и большой фрагмент для вставки отделяют от малых фрагментов векторов при помощи электрофореза в агаре с низкой температурой гелеобразования, Гелевый срез, содержащий вставку, растворяют в 3 объемах воды при температуре 65 С, а порции, содержащие 10 нг ДНК вставки, снабжают меткой с использованизгем Р при помощи олигонуклеотидной затравки,с) Гибридизации по Саузерну,Пробы геномной ДН К обрабатывают рестриктазами и подвергают электрофорезу. ДНК переносят на фильтры, фиксируют при помощи ультрафиолетового облучения и проводят предварительную гибридизацию при 65 С в течение 5 мин в 0,5 М фосфате натрия, 7% ДСН (додецил сульфата натрия), 1 ММ ЭДТА (рН 7,2), Затем фильтры гибридизуют в течение ночи с 0,5 мг/мл Р-меченой ДНК зонда (удельная активность примерно 10 имп/мин/мкг ДНК) в присут 9ствии 25 мкг/мл разрезанной однонитевой конкурентной ДНК плаценты человека. После гибридизации фильтры промывают при температуре 65 С в 40 мм раствора фосфата натрия, 1 оДСН (рН 7,2), затем промывают при температуре 65 С в 0,1 х ЯЯС (15 мм 1 чаС 1, 1,5 мм тринатрий цитрата, рН 7,0), 0,1% ДСН, Фильтры оставляют на авторадиографию в течение от 3 часов до 1 недели при температуре - 80 С в присутствии интенсифицирующего экрана,с 1) Определение тандемной повторяющейся последовательности 1 С-рекомбинантов.Каждую МС-рекомбйнантную ДНК подвергают обработке ультразвуком. отбирают фрагменты размером 0,3 - 0,6 т,п,о. и клонируют в сайт Ягпа 1 1 13 гпр 19, Рекомбинантный фаг отбирают при помощи гибридизации бляшек с Р-меченой МСзг вставкой ДНК. 10 строго положительных однонитевых ДНК фага из данных рекомбинантов сравнивают парами при помощи С-теста, Большая часть ДНК разбивается на 5 две группы в соответствии с С-тестом и поэтому весьма правдоподобно, что они получены из длинной тандемно повторяющейся области 1 МЯ-вставки. Два 113-рекомбинанта каждой из двух комплементарных 10 групп анализируют на состав "последовательности при помощи метода концевого лечения леотидных цепей Сангер, Никлен и Кулсон (1977), Ргос. Иат 1. Асас 1) с тем, чтобы определить повторяющуюся последова тельность каждого МС-рекомбинанта наобеих нитях.П р и м е р 2. а) Выделение гипервариабельных зондов ДНК.Яаи ЗА-фрагменты после селекции по20 размеру в области 6-15 т,п.о, из ДНК, собранной у 40 случайно выбранных индивидов, клонируют в векторе с Замещенным сайтом Вэгп Н 111 47.1. Так какчеловеческие минисателлиты могут обладать существен ной аллельной вариацией по длине, применение объединенных человеческих ДНК с целью клонирования больших Яао ЗА-фраг-ментов, должно увеличить количество кло-нируемых гипервариабельных участков, 30 которые содержат большие Яац ЗА-аллели.Из библиотеки, состоящей из 2000 реком- бинантов, изолируют 5 фагов при помощи гибридизации с человеческим минисэтеллитным зондом 33,15, а дополнительные 5 35 фагов обнаруживают при помощи зонда33,6 с тем, чтобы получить МС-серии рекомбинантов.Для того, чтобы определить, может ликаждый А МЯ-рекомбинэнт действовать как 40 специфический относительно определен-ной области зонд для гипервариабельного минисателлита, Яао ЗА-вставку каждого рекомбинанта подвергают гибридизации в присутствии человеческой конкурирующей 45 ДНК, гидролизованной рестриктазой Н 1 п 1 1оттрех случайно выбранных индивидов, при гидролизе рестриктазой А 10 1 для Я МЯ 32, минисателлитные тандемные повторяющиеся блоки которого содержат сайт Н 1 п 1 1.8 50 из 10 рекомбинантов гибридизуют с однимили двумя большими вариабельными ДНК- фрагментами в каждой из испытуемых человеческих ДНК. Четыре рекомбинанта, обнаруженных при помощи зонда 33,6(Л 1 Я 55 8, 40, 41 и 47) гибридизуются вту же структуру вэриабельных ДНК-фрагментов и, следовательно, они получены из того же гипервариабельного участка, 2 мкг пробыДНК от трех, не связанных между собой