Способ получения изомальтулозы

: НййБсйИя РЕСПУБЛИК ОЮ (1) щ) С 12 Р,19/12 САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТИН(5 ИА зу Х 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ СЦ) 321 0740/28-13(46) 07.04.83. Бюл. И 13 (7 Й) КристоФер Вак и Питер Самуэл Джеймс Читем (Великобритания), (71) Тейт энд Лайл Пейтент Хоудинг Лимитед (Бермудские острова) (53) бб 3.15,. (088.8)(56) 1. Патент Великобритании Н 1429334, кл. С 2 С, опублик. 1972, Европейское патентное о исаниейф 0001099,кл. С 12 9 13/02 П, 0 публик. 1979. 4) 57) 1. С ЛЬТУЛОЗЫ пут ащения раста ванием изома кроорганизмо ления и крис , о т л и ч о, с целью и продуктивнос ющих микроор ксируют путем пользуют для зц из раство Ф (вес/об,) ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИЗО- ем Ферментативного пре" оров сахароэц с исполь" льтулозуобразующих в и последующего вц" таллизации иэомальтуло-. а ю щ и й с я, тем, овцщения стабильнрсти . ти изомальтулозуобраганизмов, последйиевключения в гель и получения изомальту" ров, содержащих 40" сахароэц.10110 Концентрациябелкав экстра ктахмг/мл Активность поверхностного слоя Удельнаяактивнэстьзгизомальтулозы/мг белка/ч Активность исходных клеток, г изомальтулозы/гвлажн веса/вес Активность клеточных осколков,г. Способыразрушения изомальту" г изомаль г изомальлозытгзлаан 1 тупозы/г тулоны/веса исход- влаж.веса мл экстзных клеток/ц исхбзных )ракта/цклеток/ц ) Встряхивание поМикле 0,567 0,63 Осмотический 0,70 0,63 0,0380,042 0,4650,514 шок Ультразвук Обработка Тритоном Х"100 0,048 0,92 0,16 П р и м е р 9, ферментативную систему, ответственную за превращение сахарозы в изомальтулозу, экстрагируют растворителем из клеток Его п 1 а гпаропйс 1 М СРРВ 1578, В используя четыре разлиных способа, в частности встряхивание по Микле (М 1 сО е), осмотический шок, ультразвуковую обработку или обработку детергентом. 1 ОДля встряхиваний по цикле 2 г навески свежесобранных клеток встряхивают с 2 г сухого песка и с 2 мл дистиллированной воды 20 мин при комнатной температуре, используя ус тановку для встряхивания Микле.Для способа осмотического шока 1,5 г навески клеток суспендируют в 10 мл деионизованной воды 30 мин при 1 О С.20Для ультразвуковой обработки 2 г навески клеток суспендируют в 15 мл деионизованной воды и обрабатывают Из результатов, приведенных в табл. 6, видно, что при встряхивании ,4 у по Микле в поверхностный слой попадает примерно 5/ активности клеток, а остальная активность связана с клеточными осколками. Растворимый Фер ,ментный экстракт, т.е, поверхностный слой, обладает активностью 0,094 г продукта/мл/ч, удельной активностью 0,0027 г. продуктов/мг белка/ч и показывают двенадцать различных белковых полос при анализе с помощью полиакриламидного гелевого электроФореза.ферментативную систему можно более эффективно экстрагировать с по 56 18ультразвуком 30 мин, используя генератор диаметром насадки 2,5 см.Для обработки детергентом исполь-, зуют 10 мл водного раствора Тритона Х( 0,15 об./об.), чтобы обработать 0,5 г клеток.После каждой соответствующей обработки полученные суспензии подвергают центрифугированию при 17000 9 в течение 30 мин при 30 ОС;Клетки или клеточные осколки и поверхностный слой жидкости затем по отдельности Фиксируют на гранулах альгината кальция, используя общий метод примера 1.Затем гранулы подвергают испытанию по отношению к 554 ( вес./об. сахарове для определения активности синтеза изомальтулозы.В табл. 6 приведена активность изомальтулозуобразующих микроорганизмов при разных способах разрушения клеток.Таблица 6 . 0,094 0%094 32 у 6 Ч,0029. 0,253 3,0 0,0844 Ое 0056 1 е 99 0,0028 мощью осмотического шока клеток. С помощью этого способа экстрагируют примерно 9 ь клеточной активности, причем экстракт имеет активность 0,253 г продуктов/мл/ч и удельную активность 0,0844 г продукта/мг белка/ч. Более того, электрофорез в полиакриламидном геле показывает только десять белковых полос. Сравнительно высокая чистота такого Ферментативного экстракта вероятно обусловлена тем, что клетки не разрываются под действием осмотического шока.Ферментативная система связана с мембраной и/или заключена в клет19 1011056 20 ке, причем более вероятным местом темы ниже, чем для свободных клетокрасположения является периплазми-( 554) или для зафиксированных клеческое пространство, особенно в си- .ток, по-Ьидимому, отражает изменение . лу того, что осмотический шок явля- - внутренних свойств Ферментативной ется самым лучшим способом экстрак-системы, зависящей от локализации. ции, а также потому, что такие связан" Когда ферментативную систему, экстные с периплазмическим пространстйом рагированную встряхиванием по Иикле, Ферменты, как кислая Фосфотаза, так- используют на 553-ой ( вес./об,) саже были экстрагированы при обработ- харозе, зафиксированный фермент обке осмотическим шоком, 1 ф ладает исходной активностью 0,0067 гИз данных табл, 6 следует, что продукта/г гранул/ч и имеет полуйедробленые клетки обладают наиболь" риод жизни 620 ч, обеспечивая первошей активностью. Это, вероятно, вы" начальную степень превращения 81,5.звано устранением препятствия для Таким образом, использование преддиффузионного переноса субстрата, ю лагаемого изобретения позволяет резкосоздаваемого стенками и мембраной не увеличить стабильность и продуктив- .поврежденной клетки. Однако нет су- ность изомальтулозуобразующей систе"щественного различия активностей , мы, как за счет ее иммобилизации вклеток, подвергнутых осмотическому геле, так и благодаря использованиюшоку, нежизнеспособных клеток и све- в новых штаммов микроорганизмов рода , жих жизнеспособных клеток, что на- , Егтп 1 а, применению более концент"глядно показывает, что здесь не дей- рированных растворов сахарозы и боствует активная транспортная систе. лее полному превращению сахарозы в ма для притока сахарозы внутрь клет- целевой продукт. ки, поскольку такая система была бызависима от интегрального метаболиз- Так, иммобилизация в геле альгима целой клетки и она могла бы быть, ната кальция позволяет увеличить врепо-видимому, утрачена при осмотичес" мя полужизни клеток от нескольких до ком шоке клеток. 8500 ч, а использование 15 и 553"х, Дальнейшее исследование свободно- растворов сахарозы приводит к 1,5 ЗОго от клеток ферментного экстракта, 10-кратному увеличению стабильности полученного осмотииеским шоком, по- клеток по сравнению с опытами, в казало, что он имеет оптимальное зна- которых применяют 353-".ые растворы, чение рН,.равное 7,0, оптимальнуюбез существенного изменения актив- температуру 30 С и обладает макси- ности системы. Кроме того, изобре.мальной активностью для 35 вес./об.)зф тение позволяет: использовать изомальраствора сахарозы. Тот факт, что тулозуобразующую систему микрооргаоптимальная концентрация субстрата низмов без культивирования и размнодля растворимой ферментативной сис"жения самих микроорганизмов, 1011 056УФУФ 8 Витедь В. ИурОнецеа А.БабинеиЮ Ф ыфаврю авае ев Ю Ю Ю Вв Ю ФВ Ю Ю Юж 521дарственного коиитетазобретений и открытиЖ- Рауиская наб.Уент", г. Ужгород, ул Корректо АПодписноеСССР ВТКО делам ИоскваП "Пат Ю Ю Ю фВ Юектная, Ц СостРевактоо С. Йско Техрй ОЕ4 Ю 4 ЮЗаказ.216/ ТирйВНИИПИ Госу10112. Способ по и, 1, о т л и ч а ю- щ и й с я тем, что в качестве изо,мальтульэуобразующего микроорганизма используют Егц 3 п 3 а гЬаропй 3 с 3 штаммы МСРРВ 1578, МСРРВ 139) МСРРВ 1739 или АТСС 29284.3. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что изомальтулозу" образующий микроорганизм Фиксируют в виде целых клеток. 056Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что для Фиксации ис"пользуют растворимый экстракт целых,или дробленцх клеток изомальтулозу -образующего микроорганизма,5, Способ по и. 1, о Т л и.ч а ю 1 ц и й с я тем, что в качестве геля используют альгинат" ный гель.поЬочных процессов при аэробной ферментации микроорганизмов, которые приводят к образованию веществ, загрязняющих изомальтулозу,Цель изобретения - повышение стабильности и продуктивности изомальтулозуобразующих микроорганизмов.Поставленная цель достигается согласно способу получения иэомальту" лозы путем Ферментативного преьращения растворов сахарозц с использованием изомальтулозуобразующих микро,организмов и последующего выделения и кристаллизации изомальтулозы, изомальтулоэуобразующие микроорганизмы Фиксируют путем включения в гель и используют для получения изомальтулозы из растворов, содержащих 40-553 вес/ /об. сахарозц.,Для Фиксации используют растворимый экстракт целых или дробленцх клеток изомальтулозуобразующего микроорганизма.В качестве геля используют альгинатнцй гель.В предлагаемом способе используют иммобилизацию для закрепления Фермента или Ферментов, образующих Ферментативную систему, участвующую в превращении сахарозы в изомальтулозу.Можно испольэовать Ферментативную систему, экстрагированнуе .из изомальтулозуобраэующего микроорганизма, наНедостатками указдннцх способов фф является необходимость использова" ния растворов сахарозц с концентра" цией ниже 401предпочтительно около 25)недостаточно высокая продук" тивность изомальтулозуобразующих мик" ф роорганизмов, а также протеканиеИзобретение. относится к микробио"логическому синтезу веществ и можетбыть использовано для Фермвнтативного получения изомальтулозц из сахарозы, которая может найти применениев пищевой промышленности.Известен способ получения изомаль"тулозы из сахарозы микробиологическим способом при Ферментации раство,ра, содержащего от 15 до 404 вес./ 10/вес. сахароэы. Образующуюся изо" мальтулоэу выделяет Фильтрованиеми кристаллизуют Г 1.Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигаемо; Иму эФФекту является способ получе"ния изомальтулозы путем Фермента"тинного превращения растворов сахаро;,зц с использованием изомальтулозуобрвэуещих микроорганизмов, например 26Ргойол 3 поЬасйег гцЬгцщ или Зеггай 3 ар 1 упаЬ 3 са, и последующего выделенияи кристаллизации изомальтулозы. ДляФерментации использует раствор с содержанием сухого вещества от 5 до зз304, предпочтительно от 20 до 273,причем сахароза составляет от 90до 984 сухих веществ, Кроме Ргойоп 3-,поЬасйег гиЬгов и Беггай 3 а р 1 уацйп 3- са могут быть использованы Беггай 3 ащагэсеэсепэ Егюп 3 а саго 1 очога или3 ецсопоэ 1 ос веэепйегойеэ в качест"ве иэомальтчлоэуобраэующего микроорганизма 21. Кроме того, в качестве изомальтулозуобраэующего микроорганизма ис" пользуют Еги 3 п 3 а гЬаропй 3 с 3 штамма МСРРВ 1578 ф МСРРВ 139 э МСРРВ 1739 или АТСС 29284.Изомальтулозуобразующий микрооргат низм Фиксируют в виде целых клеток.6 4 3 101105пример целые или дробленые клетки микроорганизма, при этом клетки служатносителем для ферментативной системы.Некоторое деление целых клеток может происходить после иммобилизации,но желательно, чтобы способ иммобилизации и другие параметры процесса были выбраны таким образом, чтобы деление отсутствовало или было минимальным,Для иммобилизации ферментной системы могут быть использованы различные способы, но наиболее удобным является задержание в геле, поскольку Иэтот способ пригоден для иммобилизации Ферментативно-активного экстракта клеток, а также целых или дробленых клеток. Подходящие материалыдля геля включают альгинатполиакрил Оамид, агар, смесь ксантановой смолы(смолы лжеакации, каппа-частицы карагенана или смесь каппа",частиц караге. нана), смолы лжеакации, коллаген илиацетатцеллюлозу. Из этих материаловальгинатный .гель, в частности гельальгината кальция, дает наилучшие результаты. Иожно использовать другиеальгинатные гели, например те, которые образуются с другими металлами 1 1группы.Гель альгината кальция характеридуется высокой скоростью проникающейдиффузии сахаровы и низкой скоростьюутечки наружу целых клеток и белка.,Дополнительным преимуществом является исключительная стабильность изомальтулозуобразующей активности у фиксированных целых клеток,:Полупериодактивности клеток, задержанных в геле альгината кальция, достигаетао10000 ч, причем 8500 ч является типичной величиной, в то время как самыйдлительный полупериод в сравнимых ус"ловиях при других способах иммобилизации составляет ниже 1000 ч. а 5 Кроме того, иммобилизация в альгантном геле не приводит к существенной потере активности.Для иммобилизации Ферментативной системы 1 самой по себе, либо в целых или в дробленых клетках) в альгантном геле смешивают Ферментативную систему с водным раствором растворимого альгината, например альгината натрия. Оптимальной процедурой является суспендирование целых клеток с растворимым альгинатом. Концентрация клеток составляет 1-90 влажного веса к объему, более оптимально 10-40, еще лучше 20.Наиболее приемлемые концентрации растворимого альгината для использования с целыми клетками ияи с дру" гимн видами Ферментативной системы составляют 1-103 1 вес./об.), более предпочтительно 53( вес./об).Полученную, альгинатную смесь дозируют в раствор соли металла, с которой растворимый альгинат образует гельЕсли гелем является альгинат кальция, то подходящие соли включают хлористый кальций концентрацией 0,01" 1,0 И, предпочтительно 0,05-0,5 М или 0,1 М. Температура раствора соли металла при дозировании 15-40 С, предпочтительно около 30 ОС, раствор перемешивают. Стабильность Фиксиро" ванной ферментативной системы увеличивается, если раствор соли металла содержит также некоторое количест" ворастворенной сахарозы, например 5-40вес./об.) сахарозы, предпочтительно 20.При дозировании суспензии или дру" гой альгинатной смеси в виде отдельных капель можно .получить сферические гранулы геля, удерживающего ферментативную систему. Размер гранул может изменяться, но для легкости обращения и для обеспечения высокой эффективности переноса массы при использовании, желательно использовать гранулы диаметром 3-5 им. Однако размер и форма имеют мало значе" ния. Можно Фиксировать Ферментативную систему в блоке геля (который для использования навивают. на форму или нарезают на части), либо в микроволокнистых частицах (при использовании условий высокого градиента при дозировании альгинатной смеси). Используют и другие гели.Каппа-карагенан или смесь каппа" карагенана смолы лжеакации используют в таком же способе, который ис" пользовали для альгината, за тем исключением, что раствор, в который экструдировали клеточную суспензию; представляет собой смесь 1 И СаС 1 и 1 М КС 1 при 20 ОС. Агар получают путем кипячения 3 Ж( вес./об.) агара в деионизованнойводе, охлаждают полученный гель до50 С, добавляют суспензию клеток иэкструдируют полученную суспензиюпо каплям в ледяную воду.011056 6кулярным весомМожно использоватьмутанты бактерий природного происхождения,Иэ штаммов, принадлежащих родую Еги 1 п 1 а, желательны штаммы Е,рЬаропс 1 с 1, которые хранятся в Британской Национальной коллекции растительных патогенных бактерий по ре 1 гистрационным номерам В СРВ 1578,5Смесь ксантана/смолы лжеакацииполучают с помощью методики, что идля агара, но смолу нагревают до80 С, а гель перед добавлением клеток охлаждают до ба С.Используют полиакриламид по способу Чибаты (СЬЬайе ей а 1, (МейЬод 5п Еплугпооду, 44, 1976, р. 739).Для иммобилизации целых или дробленых клеток изомальтулозупродуцирующего микроорганизма можно использовать другие способы иммобилизации.Например, клетки можно Физически адсорбировать на инертном носителе;,:ковалентно связать их с инертным но"сителем; агрегировать с помощью по"перечно-сшивающего реагента, приэтих способах, однако, сохранение активности и стабильность активностиниже. Вместе с тем эти способы иммобилизации обладают другими преимуществами. Так, при адсорбции клетокна целлюлозе жидкость, полученнаяпосле превращения, кристально прозрачная, что свидетельствует о том,что все примеси адсорбированы ДЕАЕцеллюлозой,Иммобилизация дробленых клетокили растворенных экстрактов фермен"тативной системы позволяет полностьюизбежать клеточного деления, про"исходящего во время их использования, благодаря чему устраняется рас"трескивание гранул и блокировка пор,что иногда происходит при деленииФиксированных целых клеток внутригранул геля альгината кальция. Более того, при Фиксировании дроб"леных клеток или растворенных экстрактов начальная активность являет"ся более высокой, что показываетотсутствие неповрежденных мембранстенок клетки, которые могут действовать как барьер, препятствующий диффузии сахарозы или иэомальтулозы, Дробление можно осуществитьс помощью шаровой мельницы или другой обработкой целых клеток. Источником Ферментативной системы, используемой для иммобилизации, является изомальтулозупродуцирующий микроорганизм рода Еги 1 п 1 а. Иож. но использовать бактерии других родов - Бегчай 1 а р 1 увойЬ 1 са или Ргойав 1 поЬасег гцЬгця, но первый иэ названных возможно является патогенным для человека, а последний склонен продуцировать нежелательный красный пигмент с малым моле 10 1 20 И 30 35 46 45 й СРРВ 139 и Н СРРВ 1739. ШтаммаСРРВ 1578 хранится в Американской коллек" ции типов культур под регистрационными номерами АТСС 29283.ш 1 таммы М СРРВ 1578, 139 и 1739 являются наиболее перспективными, поскольку обладают более высокой специфичностью продуцирования, большеи первоначальной активностью и стабильностью по сравнению с другими штаммами Егип 1 а или с другими штаммами других родов.Способ проводят как непрерывный процесс путем загрузки зафиксированной Ферментативной системы в колонну и пропускания субстрата сахарозы в виде раствора через колонку или несколько колонок, установленных параллельно, например, на карусели. Размер колонки больше 20 мл. При обьцном превращении сахарозы в изомальтулозу образуется некоторое количество двуокиси углерода. При использовании зафиксированных целых клеток легче выводить этот углекислый гаэ, если жидкость пропускают через колонку вверх. Пропускание жидкости вверх способствует ожижению слоя зафиксированной Фер. ментативной системы и позволяет из" бежать уплотнения, которое возможно при пропускании жидкости вниз.В качестве субстрата используют раствор сахарозы, содержащий не менее 30предпочтительно неменее 40 и лучше всего неменее 503 вес.об. сахаровы,Стабильность ( измеряемая временем полупериода жизни Ферментативной системы синтеза изомальтулозы в зафиксированннх клеткахувеличивается сувеличением концентрации сахарозы, аналогично увеличивается концентрация изомальтулозы в конвертированной жидкости.На Фиг. 1 изображен график зависимости стабильности зафиксированных клеток от концентрации раствора саха розы; на фиг. 2 - влияние концентрации сахарозы на продуктивность зафиксированных клеток.Данные полуценыпри использовании гранул альгината кальция с зафиксированным штаммом Е.гЬаропй 1 с 1 М СРРВ 1739.7 10110При увеличении концентрации саха- розы выше 30-.104 стабильность и продуктивность существенно возрастают, что обусловлено главным образом свойством зафиксированной изомальтулозуобразующей Ферментативной системы, а не особенностями способа Фиксирования. Способ иммобилизации с использованием альгината кальция в этом случае дает лучшую стабильность. 1 фКроме того, высокая концентрация сахарозы способствует йнгибированию деления зафиксированных клеток и предотвращает микробное заражение, облегчает выделение продукта и умень% шает объем обрабатываемой жидкости.Верхний предел вязкости раствора заключен.от 100 до 1000 сП, как правило около 500 сП.Для способа с использованием кле- щ ток, зафиксированных в гранулах геля альгината кальция, концентрация сахарозы в исходном материале составляет около 554вес./об.) .Субстрат не обязательно должен быть раствором чистой сахарозы, вместо последней можно включить в раствор до 15/ (об./об.) мелассы или использовать материал, получаемый на, сахарном заводе, или "родственныйэо сироп", причем эт два типа примесей получают при обычном рафинировании сахара.Превращение сахарозы в изомальтулозу проводят при 15"10 С, более ,предпочтительно при 20-35 С, особено но приемлема температура около 30 С; рН раствора сахарозы 5-9, наиболее предпочтительно около 7, Превращение в изомальтулозу обычно приводит к закислению среды, но на. практике обыч- фф но нет необходимости включать стадии для поддержания значения рН в преде-лах от 5 до 9. 8 любом случае образование кислоты обычно уменьшается при увеличении концентрации субстра- .43 та. Способ проводят так, чтобы осу ществлялось в контролируемой степе" ни превращение сахаровы в изомальтулозу и в сопровождающие продукты. При увеличении времени пребывания сахарозы в контакте с зафиксированной ферментативной системой увеличи" вается степень превращения до практического максимума от 85 до 100 саИ харозы превращается в продукты Однако максимальная продуктивность необязательно достигается при самой высокой степени превращения,по"тому что большая пропускная способность и более высокая активность,полученные благодаря меньшему времени пребывания, могут компенсировать потери при работе не с максимальным превращением,Таким образом, максимальная про-,дуктивность достигается при работене с максимальным превращением, аобычно при превращении в продуктыот 70 до 953, Для гранул альгинатакальция с зафиксированными клетками Егы 1 па обычно наблюдается максимум продуктивности, если работают при превращении от 80 до 903.На фиг. 3 изображен график эависимости продуктивности зафиксированных клеток от исходного процента превращения ( т.е. процент превращения проэкстраполирован назад к нулевому времени ),Данные получены при использовании гранул альгината кальция с зафиксированными клетками Е.гйароп;ас М СРРВ 1739. Имеется заметный максимум продуктивности вблизи значения от 85 до 90 степени преварщения сахарозы в изомальтулозу и в сопутствующие продукты,Степень превращения сахароэы в продукты значительно влияет на стабильность изомальтулозуобраэующей Ферментативной системы зафиксированных клеток. Стабильность может экспоненциально возрастать при увеличении степени превращения концентрированного раствора сахароэы.На Фиг. 1 изображен график зависимости полупериода жизни зафиксированных клеток от исходного процента превращенияпри 553-и превращениираствора сахарозы). Данные получены при использовании гранул альгината кальция с зафиксированными клетками Е.гпаропй 1 с 1 й СРР 8 1739.Стабильность возрастает экспоненциально.до значения примерно 8500 ч при 903-м превращении. После получения иэомальтулоэы .ее можно закристаллизовать либо очистить другим образом.Для пищевых и родственных продуктов можно использовать эакристаллизованную изомальтулоэу, которая не обязательно должна быть чистой, в не"которых случаях можно использовать11056 околонку30 см высоты, 5 см в диаметре ), снабженную рубашкой охлаждения,Затем готовят раствор сахароэы55/ ( вес./об.) в деионизованной водеи доводят рН до 7,0 с помощью 1,0 Мл ЙаОН. Сахарный раствор прокачиваютвверх через колонку при 30 дС. Прискорости потока сахарозы примерно1 О 0,01 объемов пустой колонки/ч превращение сахароэы в изомальтулоэуи другие продукты достигает равновесия. Равновесное состояние достигает"ся через 24 ч. К этому времени актив 1 ность зафиксированных клеток составляет примерно 0,2 г продукта /г,влажн.клеток/ч. Стабильность клеток, выраженная как полупериод жизни, составляет примерно 1 год. Когда скорость потока сахарозы увеличивают так,что превращение снижается до 803,активность составляет примерно,0,325 гпродукта/г влажн.клеток/ч,Собирают элюат колонки, выпариваютпримерно до 701 ( вес./об.) , при 60 С,затем дают остыть, либо принудительно охлаждают при перемешивании, получая при этом маленькие белые кристаллы. Кристаллы можно выделить:быстреепутем затравки охлажденного растворанебольшим количеством сухой изомальтулозы. Кристаллы собирают Фильтрова. нием или центрифугированием и высуши. вают при 40 С и 700 мм рт.ст, в вакуумной печи, Продукт подвергают анаЗф лизу, а затем испытывают. Кристаллысодержат 94,5 Ф изомальтулозы, приэтом одна молекула кристаллиэационной воды приходится на молекулу иэомальтулозы, остальное составляют другие сахара. Трехкратная перекристаллизация дает чистую изомальтулозу.Если субстрат на 804 превращаютв изомальтулозу и сопутствующие продукты, получают 88 г кристалличесфф кого продукта на 100 г сахарозногосубстрата, а продуктивность колонкисоставляет 0,30 т сухого кристаллического продукта/объем колонки/Год Количество( г/л дистиллированной воды ). Компоне хароэ Пептон ( переваренный казеин) ясной экстрак 9 10 незакристаллизованный продукт, содержащий примеси.П р и м е р 1, Клетки из культуры Еги 1 п 1 а гЬаропй 1 с М СРРВ 1578, АТСС 29283) разбавляют 10 мл фосфат" ного буфера, 0,10 мл полученной суспензии используют для посева на 200 м питательной среды в стериллиэованных конических колбах с перегородками ем" костью 500 мл.Состав среды указан в табл, 1.Таблица 1 Колбы с посевами трясут со скорос" тью 120 колебаний в мин при 30 С вф течение 70 ч, затем собирают биомас" су, Клетки собирают в стационарной фазе роста, но можно собирать влогарифмической Фазе роста или в фазе смерти. Клетки центрифугируют при 1500010 мин при 30 С, получают примерно 1 г утрамбованных влажных клеток на 100 мл среды (если нужно обработать большие объемы ин" кулируемой среды, используют центрифужный ротор непрерывного действия,через который прокачивают среду со скоростью 100 мл/мин).Собранные утрамбованные клетки суспендируют в растворе альгината натрия 57; (сухого вес./об.) в деиониэированной воде с тем, чтобы получить 20 ( влажн. вес./об. суспензию клеток ( вес клеток в граммах называют влажным весом (,влажн.вес); приблизительно перевести в сухой вес можно путем деления на 5. Активности клеток выражены в расчете на грамм влажных клеток), Клеточную суспензию , экструдирую по каплям с высоты 10 см в перемешиваемый раствор хло- ристого кальция ( 0,1 И ) с температурой 30 С, содержащий 20 ( вес./об.у сахароэы, которая служит для стабилизации изомальтулозуобразующей активности клеток, Полученные гранулы перемешивают 1 ч, затем помещают в Во время рабочего использования количество жизнеспособных клеток и зафиксированных клеток быстро умен шается: количество жизнеспособных клеток достигает нуля примерно через 500 ч рабочего использования. После этого периода не остается жи неспособных клеток и не видно инво ционных Форм клеток, Несмотря на11 1 О 11 О сравнительно быструю потерю жизнеспособности, изомальтулозуобразующая активность зафиксированных клеток спадает независимо и намного медленнее с временем полураспада 354 дня.Это показывает, что жизнеспособные клетки не нужны для образования иаомальтулозы, и, что возможно имеется единственный стабильный фермент, который превращает сахарозу в 1 О иэомальтулозу, для которого не требуется рециркулирование кофакторов или непрерывная регенерация источников энергии, Это подтверждается опытом, когда в качестве субстрата ис% . пользуют в 554-ной ( вес./объем ) сахарозе О,1 г/л хлорамфеникола, которий ингибирует синтез белка, Активность синтеза изомальтулозы не изменяется, но деление клеток прекра о щается, даже при добавлении питательных веществ.Можно вызвать новый рост клеток Еги 1 п 1 а на месте посредством подачи питательных веществ в виде свежей р стерильной среды даже при использовании их в колонке непрерывно в течение долгого времени; изомальтулозуобразующая активность падает о небольшой доли от ее первоначального значения. В этих опытах среду прокачи. вают вверх через колонку со скоростью 0,01 объемов пустой колонки/ч. Значительные количества СО выделяются при этом клетками, зафиксированными в гранулах, значение рН отработанной з среды, вымываемой иэ колонки, падает до 4,4, наблюдается увеличение числа жизнеспособных клеток, как в гранулах, так и в отработанной среде, причем40 анализ азота, как отработанной среды, так и гранул клеток, показал, что происходит рост клеток, После возврата назад к 554-ной сахарозе в качестве субстрата изомальтулозуобразующая активность гранул возрастает в некоторых случаях до уровней, превышающих первоначальную активность . Нет доказательств образования фермента в исходных клетках, но есть факт, что регенерация вызвана исключительно ростом клеток. Степейь восстановления активности гранул пропорциональна числу жизнеспособных клеток, оставшихся непосредственно перед добавлением питательных веществ, и никакоИ го восстановления активности не наблюдают в гранулах, которые использовали в течение столь длительных пе 56 12риодов времени, что все зафиксированные клетки сделались жизнеспособными (500 ч).После рабочего использования регенерированных клеток в течение последующего периода активность колонки можно активировать аналогичным способом не менее 3-х раз. Воэможность регенерации колонок с зафиксированными клетками обеспечивает теоретически бесконечную стабильность колонки и говорит о том, что возраст зафиксированных клеток не зависит от пропускной способности субстрата.Вместо подачи питательных веществ непосредственно после использования гранул в течение некоторого периода времени питательную среду можно подать в колонку непосредственно после фик" сирования. В этих опытах медленный рост клеток Егип 1 а происходит на месте. Когдафиксируют 1 Ф ( влажн. вес./об.) клеточный материал гранул, наблюдают 30-кратное увеличение числа жизнеспособных клеток, причем рост клеток происходит с временем удвоения 64 ч до окончания опыта, обус;, ловленного сильным ослаблением струк-туры альгинатного геля. Когда клетки используют таким образом, при частом восстановлении активности посредством -обеспечения условий для роста клеток, внутренняя стабильность ферментативной системы меньшая, чем в том случае, когда не происходит рост клеток. Таким образом, фермент является намного стабильнее, когда клетка находится в псевдопокое или в состоянии сохранения, чем когда ей дают возможность делиться.П р и м е р 2. Используют основную методику примера 1 с дополнительной стадией, в которой собранные клетки дробят шаровой мельницей в течение 90 мин при 8 С перед фиксирова.- нием. Исходная активность гранул такая же, как и при использовании целых клеток в примере 1, но полупериод жизни составляет примерно 170 дней.П р и м е р 3. Способ осуществляют по примеру 1, используя .другие штаммы изомальтулозуобраэующих микроорганизмов, в частности Егы 1 п 1 а гЬаропсс 1 (й СРРВ 1578, 139 и 1739 и АТСС 29284), Еги 1 п 1 а сагаочога чаг айгоьер 1 са И СРРВ 139, Егы п 1 а дзьо 1 чепз (М СРРВ 1862 и 2209), Ргойаа 1 поЬасйег гцЬгцв (СВ 5 574, 77) ф 5 е гча йа ва ззсезсепз (М С 1 В 8285) и1 Пригод",ность Итамм Е.гЬаропйс МСРРВ 1578 13 1011 5 еггаа р 1 ущцЬса (АТСС 15928).Измеряют специфичность, активность и стабильность зафиксированных штаммов. Затем, принимая во внимание патогенность микроорганизмов и тенденцию йродуцировать полимер или пигмент, исследуемые штаммы оценивают на пригодность их использования в способе по примеру 1.В табл. 2 приведена пригодность 10 штаммов для получения изомальтулозы,Табли ца 2Е.гЬаропес МСРРВ 139Е,гЬаропс МСРРВ 1739Е.гЬаропйс АТСС 29284Е.сагойочога чаг айгоэерйса МСРРВ 139 Е.дээо 1 чепэ МСРРВ 1862 Е.д 550 чепэ МСРРВ 22095 еггайа рупщйЬсаАТСС 15928 еггайа оагэсеэсепэЙСВ 8285 РгойащпоЬасйег гцЬгцеСВ 5 574.77 + П р и м е р 4. Осуществляют способ по примеру 1, используя концентрацию сахарозы от 12,5 до 603вес./ /об.). Активности и полупериоды жизни были измерены при исходном проценте превращения, равном 4 В.В табл. 3":приведено влияние концентрации сахарозы на образований иэомальтулозы.Таблица 3 Полупе"риод жиз 12 5 0,4 0,7 47200 Концентрация сахарозы, Ф, вес.об,Активность г/блджн.вес клеток/ч 26 . Изменение концентрации сахарозывлияет на производительность фиксирующих колонок. Концентрация сахароэы влияет на активность зафиксированных клеток, причем концентрации 2 свыше примерно 404 ( вес,/об.) оказывает ингибирующее действие, Стабильность 1 т,е, полупериод жизни) зафиксированных клеток существенно возрастает при увеличении концентра- ЗВ ции сахарозы выше тех значений концентрации, которые использовали впредыдущих работах, Увеличение стабильности зафиксированных клетокпри увеличении концентрации сахарозы перевешивает уменьшение активности, поэтому продуктивность колонкивозрастает с увеличением концентрации сахарозы.На равновесное отношение продуктов к сахарозе сильно влияет концентрация сахарозы в субстрате, причемнаибольшее равновесное значение было получено при использовании 553-ой( вес./об. ) сахарозы. Таким образом,при использовании 553-ой сахароэыравновесное отношение продуктов ксахароэе составляет 13,2:1, что соответствует 93 превращения в продукты.П р и м е р 5. Способ осущест- Е вляют по примеру 1, используя клетки Егииа гЬаропйс М СРРВ 1578,зафиксированные другими способамииммобилизации.В табл. 4 показано влияние способа фиксирования активности изомальтулозуобразующих микроорганизмов на активность и полупериод жиэ101ц а Табли Ю Ю В%В Активность, г продукта/г влажных кле" ток/чСпособ фиксирования Полупери"од жизнич Альгинат кальция 8500 0,325 400 570 40 Каппа-каррагенан/смола лжеакации 0,263 37,5 0,01 Костный уголь О 34 Агар 27 Ксантан/смолалжеакации 0,10 Таблица 5 ФЮ111 тамм Е. гЬаропйс 1 Активность, г продукта/ /г.клеток/ч Полупериоджизни, ч Исходноепревращение, Ф Продуктивность, кг продукта/л объема колонки/3000 ч 59,52 52,4 0,441 11 СРРВ 157811 СРРВ 13911 СРРВ 1739 0,389 54,4 1877 52,53 56,6 0,354 1840 47,77 ЕАЕ-целлюлоза 0,583Полиакриламид 0,13 Клетки, агрегированные глутаровым альдегидом 0,153 П р им е р 6. М-метил-М "нитро- -М-нитрозогуанидин 100 мг/мл) растворяют в 25 мл 0,10 .И цитратного буФера при рН 6,0 при инкубировании в водяной бане при 37 С в течение 20 мин. Этот раствор затем добавляют к 50 мл проФильтрованного питательно" го бульона, содержащего примерно 1 г свежесобранных клеток Е. гЬаропй 1 с 1 М СРРВ 1578. Затем клетки инкубируют 1056 1630 мин при 37 С в водяной бане, потом их собирают и суспендируют в 4 Фсахароэной среде 1 табл. 1) в,течениеоночи при 4 С, Аликвоты (0,1 мл) поз мещают на 1,Я ( вес.об.) агаровыечашки, содержащие сахароэу 43 1 вес.//об.), триптон О,М ( вес./об. и пептон 1 Ф ( вес./об.), значение рН кото-,рых было доведено до 7,0, инкубиро 6 ванне проводят 48 ч при 30 С. Отдельные колонии затеи пересаживаютв колбы для встряхивания и проводяткультивирование в течение 48 ч при30 С при встряхивании при 120 об/мин,о33 затем клетки собирают, подвергают испытанию и анализу. Мутантные штаммы .менее специФичны, чем первоначальныеклетки., несмотря на то, что они продуцируют изомальтулозу,а П р и м е р 7. Способ осущест"вляют по примеру 1, используя альгинатный гель, содержащий заФиксированные клетки СРРВ 1578, который либо превращают в гель в блоке и нареу зают на Фрагменты, либо превращаютв гель в виде непрерывного шнура ииспользуют в намотанном на стерженьвиде или в виде нарезаных сегментов.При использовании в колонке эти заФиксированные клетки не проявляютзаметного различия в активности или. стабильности по сравнению с клетками,эаФиксированными в сФерических гранулах.П р и м е р 8. Пример 3 йоказыЗф вает, что наиболее пригодными являются штаммы Е.гЬаропй 1 с 1. Последующее сравнение проводят в стандартизированных условиях, используя каждыйиэ трех штаммов Е.гЬаропй 1 с 1, заФикфф. сированных в альгинате кальция.В табл. 5 приведена продуктивностьразных штаммов Е.гИаропй 1 с 1.