Способ получения антибиотика

и 11 440847 с О П И Дф",Н И Е ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических) Зависим патента Заявлено 26,04.72 (21) 1778057/30-1(32) Приоритет 27.04.71 (31) 137894 (33) СШАОпубликовано 25,08,74. БюллетеньДата опубликования описания 22.05,7 Государств овета вбил ыи комитет тров СССР 3) УДК 779.925(088.8 обретений делам и оттии Авторыизобретения Иностранц Савао Мур(71) заявител Эд оурен Пар) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТ К-спектр антидрата; на фиантибиотикаантибиотикаантибиотикаантибиотика 1-1 а фиг. 1ка ЕМвЯМР-спектрна фиг. 3на фиг. 4 -на фиг. 5 - 9 изображен И виде хлоргихлоргидрата - ИК-спектр ЯМР-спектр ИК-спектрь био ЕМЕМ,: ЕМ: ЕМИзобретение относится к области микробиологии, а именно к микробиологическим способам получения антибиотиков.Известен способ получения антибиотика путем культивирования Вас 111 цз с 1 гсц 1 апз в аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источник углеводорода, азота и минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и хроматографиче ским разделением его на активные компоненты.Предлагаемым способом антибиотик получают путем культивирования штамма микроорганизма Вас 111 цэ с 1 гсц 1 апз АТСС 21656 в 1 аэробных условиях в водной питательной среде, содержащей источник усвояемого углерода, азота и минеральные соли, до накопления в культуральной жидкости значительной активности антибиотика. 2Затем культуральную жидкость подкисляют, выпавший осадок отделяют фильтрованием и промывают водой, Фильтрат и промывные воды объединяют и экстрагируют спиртом, смешивающимся с водой, предпочти тельно н-бутанолом. Спиртовой раствор концентрируют, и антибиотик осаждают этилацетатом ацетонитрилом, эфиром или ацетоном. Продукт можно затем подвергать более тщательной очистке распределением в системе, 3 содержащей воду, спирт и органическую кислоту, например, н-пропанол, н-бутанол, воду и уксусную кислоту, или образованием соли гелиантовой кислоты и регенерацией антибиотика из этой соли.Этот процесс приводит к выделению антибиотика ЕМв виде соли с кислотой, соответствующей кислоте, применяемой для подкисления бульона. Соль превращают в свободное основание нейтрализацией, водным раствором аммиака, гидроокисью натрия, гидроокисью бария, и экстрагированием н-бутанолом.Полученный таким образом антибиотик ЕМпредставляет собой вещество с анти- микробной активностью. При более тщательном разделении антибиотик можно разделить на четыре активные фракции, близкие по структуре друг другу, и пятую фракцию, содержащую активное вещество неопределенной структуры.Все ИК-спектры сняты в КВа ЯМР- спектры - в диметилсульфоксиде д440847 7 д 3 1 С 12 15 /6 0 4.0501 аг 04 аб о,в г1 бОО гОО гОО 00 1 д О 1 бо оо г О ИОО гОО 1 доо доо гооо л оо д оо 1 в я 1 о 1 г 15 го л дол оо ог ов 1 О Жу О 4 ООО Рггг б оо об 70 4000 ХР 00 д 00 г 500 г 000 1 ОР 7 Ид 400 г 00 Соггг С об оз 10 15 В са ,.сРааРа ма а 4ов 1+ОП гаа аОВ ВРО 6 а 4 РР Яг 7 7 в 9 10 1 1 го 30 4050 7400ОО 7 ОР 500 БР440847 6 7 д 9 70 72 15 20 20 +050 02 10 4000 Д 00 5000 2 00 2 00 2 д 0 2 б 0 2400 2200 2 00 д 00 400 200 б 7 д 9 70 72 75 20 20 4050 00 02 о.г О.б Од 25 7 О1. Составитель О. СливкинаТехред В. Рыбакова Корректоры; Л, Котова и И. Позняковская Редактор Д. Пинчук Заказ 784/4 Изд.381 Тираж 456 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/53альфа, бета, гамма, дельта и МПФ соответственно,Антибиотик ЕМи фракция, полученные при его разделении, активны по отношению к грибкам, а также к грам-положительным и грам-отрицательным бактериям, например, видов Яарйуососсцз ацгецз, Ягер 1 ососсцз руодепез, Рзецйотопаз аегцрпоза, Ез 11 ег 1 сЫа со 11 и СапдЫа а 1 Ысапз.Поэтому антибиотик или его физиологически приемлемую соль с кислотой можно применять в качестве противомикроб ного средства либо для дезинфекции окружающей среды, например, в формах для разбрызгивания или распыления, содержащих примерно по 1% вещества в обычно применяемом носителе, либо для борьбы с инфекциями, поражающими различные виды животных, вызванные вышеуказанными микроорганизмами, например при нанесении в виде мазей, содержащих до 1% вещества, или в виде инъекций в дозировке 50 - 125 мг/кг веса в день. Доза ЕДюю для мышей для борьбы с инфекцией, вызванной ЕзЬепсЫа со 11, составляет примерно 50 мг/кг веса. Штамм Вас 111 цз с 1 гсц 1 апз - продуцент антибиотика ЕМ, выделен из почвы и хранится в коллекции культур в США.Морфолого-культуральные свойства. Споро- образующие бациллы грамм-отрицательные. Споры расположены центрально или субцентрально, овальные; стенки опор толстые и легко окрашиваются; спорангии отчетливо набухают, Палочки не образуют цепочек. Мазки, окрашенные 0,5% основным раствором фуксина, показывают наличие тонкой оболочки, Колонии на питательном огаре, содержащем глюкозу, блестящие с гладкими или неровными краями, очень клейкие, слизистые, подвижные, легко размазываются на поверхности агара особенно при увлажнении чашек.В питательном бульоне наблюдается мутность, тяжелый осадок, тонкая слизистая пленка.Физиологические свойства, Испытания по Воже - Проскауэру на образование ацетилметилкарбинола отрицательные, Культура индол не образует, крахмал(казеин) гидрализует газ из углеводов не образуется, Не растет при 60 - 65 С. П олучение антибиотикаШтамм Вас 111 цз с 1 гсц 1 апз АТСС 21656 продуцирует антибиотика, обладающий активностью против грам-положительных и грамотрицательных бактерий, а также грибков типа Сапййа а 1 Ь 1 сапз. Для получения антибиотика штамм Вас 111 цз с 1 гсц 1 апз АТСС 21656 выращивают в аэробных условиях в водной питатель среде, содержащей усвояемый углевод и источник азота, Ферментацию проводят в течение 60 в 1 час, предпочтительно 144 час, затем образуется антибиотик.После завершения ферментации культуральную жидкость подкисляют до рН 2 кон 5 10 15 20 25 Зо 35 40 45 50 55 60 65 4центрированной соляной кислотой, добавляют осадитель, и всю суспензию фильтруют, Осадок промывают большим количеством воды, и промывные воды соединяют с фильтратом. Промытый осадок отбрасывают. Фильтрат вместе с промывными водами экстрагируют н-бутанолом, насыщенным водой, Бутанольный экстракт концентрируют под вакуумом при температуре ниже 45 С до небольшого объема. Концентрат затем разбавляют 15 об. ч. ацетона. Полученный осадок промывают ацетоном, этилацетатом и эфиром и получают после высушивания светло-бурый порошок. Антибиотик, содержащийся в этом неочищенном препарате, подвергают последующей очистке противоточным распределением с применением системы, содержащей н-пропанол, н-бутанол, воду и уксусную кислоту в соотношении по объему 50: 75: 100: 2. Материал, полученный после 29 операций противоточного распределения, применяют для характеристики антибиотика.Антибиотик ЕМпредставляет собой пептид основного характера, образующий соли с неорганическими и органическими кислотами, При подкислении культуральной жидкости соляной кислотой получают хлоргидрат. При использовании других кислот, например неорганических, типа бромистоводородной кислоты, серной кислоты можно получать соответствующие соли этих кислот. Образующуюся соль, в виде которой сначала получают антибиотик, можно нейтрализовать основанием, например гидроокисью натрия, с получением свободного основания. Соли, не растворимые в воде, например арилсульфокислоты, типа нафталин-сульфокислоты, метилоранжа, н-фенизазобензосульфокислоты, могут быть образованы реакцией кислой соли антибиотика ЕМ, например его хлоргидрата, с солью щелочного металла арилсульфокислоты.Особенно рекомендуемым способом выделения антибиотика ЕМ.49 является способ с применением соли гелиантовой кислоты. Светло-бурый порошок, полученный осаждением ацетоном из концентрата, обрабатывают водным раствором метилоранжа, полученным осаждением соли гелиантовой кислоты антибиотика ЕМ, Гелиантат, представляющий собой аморфный порошок, в этом состоянии, подвергают очистке повторным осаждением из диметилформамида, смеси метанола и ацетонитрила и из подобных растворителей. Обработка соляной кислотой способствует повторному превращению гелиантата в хлоргидрат,Светло-бурый порошок, не растворимый в ацетоне, содержит антибиотик ЕМ. Порошок подвергают очистке, Очищенный порошок содержит близкие по строению антибиотики со структурой пептидов и характеризующиеся наличием четырех свободных аминогрупп, которые можно разделить с применением ионообменной хроматографии, 44084715 20 25 30 35 40 45 50 6065 Среду стерилизуют в течение 30 мин при121 С и паром под давлением 1,55 кг(см пе 5В том случае, когда водный раствор хлоргидрата антиоиотика ЕМ, полученный через соль гелиантовой кислоты подвергают хроматографии на колонне, заполненной карбоксиметилцеллюлозой в виде натриевой формы (например, Ватман целлюлоза СМ) и элюируют разбавленным раствором хлористого натрия, антибиотик разделяют на четыре фракции в зависимости от поверхностного натяжения вытекающего потока. Эти фракции обозначаются соответственно ЕМальфа, бета гамма и дельта в порядке проведения их элюирования, Некоторые фракции различаются по их аминокислотному составу и по различиям в структуре остатка жирной кислоты. Анализ аминокислот показал, что фракции ЕМальфа и бета не содержат фенилалапина, содержат пять остатков 2,4 - . диаминомасляной кислоты и три остатка лейцина, Фракции ЕМгамма и дельта содержат один остаток фенилаланина, два остатка лейцина и пять остатков 2,4-диаминомасляной кислоты, Фракции ЕМальфа и бета отличаются друг от друга по структуре жирных кислот, выделяющихся после гидролиза в кислой среде. Аналогично отличаются друг от друга фракции ЕМгамма и дельта.Хроматография не растворимого в ацетоне порошка в некоторых системах показала малоподвижную фракцию (МПФ), обладающую также широким спектром анти микробного действия. Эту фракцию выделяют и подвергают очистке экстрагированием н-бутанолом с последующей хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе и повторной распределительной хроматографией на колонне, заполненной кремниевой кислотой и целлюлозой, элюированием смесью, содержащей н-бутанол, изомасляную кислоту, пиридин и воду (40: 9: : 4: 10). Фракцию антибиотика ЕММПФ можно также выделить и очистить путем хроматографии порошка, не растворимого в ацетоне, на Сефадекс ЬН 20 (алкилированный сшитый декстран) с элюированием метанолом. Фракцию МГ можно легко выделять посредством образования кристаллической соли Рейнеке, получаемую в виде ярко-красных кристаллов,П р и м е р 1, Дрожжевомясной косой агар засевают микроорганизмом штамма Вас 111 цз с 1 гсц 1 апз АТСС 21656, Культуру выдерживают в термостате в течение ночи при 37 С, а затем смывают 50 мл водной среды из соевой муки в колбы Эрленмейера емкостью 250 мл. Состав ростовой среды, г:Соевая мука 15,0 Обезвоженный измельченныйкартофель 15,0Глюкоза 50,0 СоС 1, 2 Н,О 0,005СаСО, 10,0Дистиллированная вода до 1000 мл.Ьред ее использованием. Посеянную культуру выращивают при 25 С в течение 72 час при постоянном перемешивании на ротационной мешалке (280 об/мин) и при перемещении склянки на два дюйма (5,08 см).Из каждой колбы отбирают пипеткой по 2,5 об. % культуральной жидкости в колбу Эрленмеиера, содержащую 100 мл жидкой питательной среды (рН 7,0) следующего состава, г:Жидкий кукурузный экстракт 6,0 (ХН 4) НРО 4 3,0 Дрожжевой экстракт 2,5 Декстроза 10,0 СаСОз 2,5 Дистиллированная вода до 1000 мл. Среду стерилизуют под1,55 кг/см при 121 С за 15 минменением.Ростовую среду из косого агарадля инокуляции первых колб длястав среды, г:Соевая мукаОбезвоженный измельченныйкартофель давлением перед приприменяютроста, Со 15,0 15,0 Колбы выдерживают в тех же условиях. Образцы отбирают через 3 и 6 дней и изучают с применением бумажной хроматографии и биоанализа. Для бумажной хроматографии подходящее количество бутанольного экстракта подкисленной ферментативной жидкости наносят на листы бумаги Ватман Г, и хроматограмму проявляют растворителем следующего состава: н-бутанол, уксусная кислота, вода 4: 1: 5 (по объему). Верхнюю фазу этой системы используют в качестве растворителя,Антибиотик ЕМ(в виде хлоргидрата) имеет величину К 1 0,71. Антибиотик определяют биологически по отношению к штаммам микроорганизмов Яарйу 1 ососсцз ацгецв ГДА 209 Р и Езйег 1 с 1 па со 11 ЛТСС 10536. Для биоанализа эти штаммы микроорганизмов применяют обычным образом с использова нием пробирок с различной степенью разбавления.П р и м е р 2. 250 литров культуры микроорганизма штамма Вас 111 цз с 1 гсц 1 апз ЛТСС 21656 подвергают ферментации в аппарате из нержавеющей стали емкостью в 100 галлонов (378,5 л) средой в условиях, описанных ниже.Стадия 1.Инокулюм. Культуру микроорганизма штамма Вас 111 цз с 1 гсц 1 апз АТСС 21656 сохраняют в жидком азоте, выращивают на дрожжевомясном косом агаре следующего состава, г;Мясной экстракт 1,5 Дрожжевой экстракт 3,0 Пептон 6,0 Декстроза 1,0 Агар 15,0 Дистиллированная вода до 1000 мл.50,00,00510,01000 мл. 40 45 50 55 60 65 ГлюкозаСоС 1 2 НОСаСОзДистиллированная вода до Стерилизацию проводят при 121 С в течение 30 мин,100 мл этой среды, помещенной в колбу Эрлейнмейера, выдерживают в течение 72 час на роторной мешалке при 25 С. Мешалка работает со скоростью 280 об/мин, давая перемещение склянки 5,08 см.Стадия 2.Инокулюм: 100 мл материала из первой стадии.Среда такая же, как ростовая среда на стадии 1, Инокулируемый материал и 1000 мл среды в колбе Эрленмейера емкостью 4000 мл прививают в течение 72 час при 25 С на роторной мешалке (280 об/мин), перемещая склянку на 5,08 см,Стадия 3.Инокулюм: 3000 мл материала из второй стадии,Применяют среду (рН 7,0) следующего состава, г:Кукурузный экстракт (жидкий) 6,0 (ХН 4) НРО 4 3,0 Дрожжевой экстракт 2,5 Декстроза 10,0 СаСОЗ 2,5 Дистиллированная вода до 100 мл. Инокулированный материал добавляют к 250 л среды и выдерживают при постоянных условиях в течение 144 час при аэрации со скоростью 0,61 мл/мин под давлением 0,7 кг/см и перемешивании со скоростью 155 об/мин (0,4 вт/л).П р и м е р 3. Культуральную жидкость, полученную по методике, описанной в примере 2 (209 л), подкисляют до рН 2,0 1,5 л концентрированной соляной кислоты и добавляют фильтрующее средство (Гифло, 15 кг). Смесь фильтруют с образованием 41 кг нерастворимого материала. Нерастворимый осадок на фильтре промывают 10 л воды, и промывные воды соединяют с фильтратом с образованием 190 л жидкости. Промытый мокрый осадок на фильтре (41 кг) отбрасывают,Пример 4. Фильтрат (190 л), полученный ио методике, описанной в примере 3, экстрагируют трижды 56 л н-бутанола, насыщенного водой. Бутанольные слои (194 л) собирают и концентрируют под вакуумом при 45 С до небольшого объема (2,3 л).П р и м е р 5. 50 мл концентрата, полученного по методике, описанной в примере 4, разбавляют 750 мл ацетона и центрифугируют. Осадок промывают ацетоном (60 мл) суспендированием его в растворителе, а затем центрифугируют. Операцию повторяют с применением этилацетата (трижды по 60 мл) и эфира (трижды по 60 мл). Осадок высушивают на воздухе, измельчают и высушивают под 5 10 15 20 25 Зо 35 8вакуумом. Получают 1,4 г светло-бурого порошка.П р и м е р 6. 1,4 г образца, не растворимого в ацетоне, полученного по методике, описанной в примере 5, подвергают последующейочистке противоточным распределением с использованием системы, содержащей н-пропанол, н-бутанол, воду и уксусную кислоту(50: 75: 100; 2 по объему). Проводят 29 переносов по 40 мл каждой фазы на пробирку.Максимальная активность, определяемаядиффузией с применением бумажных дисков,наблюдается в пробирке 11, Содержимое пробирок 8 - 14 соединяют, и растворители удаляют под вакуумом. Остаток растворяют внебольшом количестве метанола и осаждаютантибиотик путем добавления ацетона и эфира. Осадок тщательно промывают эфиром,высушивают на воздухе, а затем под вакуумом и получают 0,466 г светло-бурого порошка. Этот порошок представляет собой преимущественно основной антибиотик ЕМ пептидного характера в виде хлористоводородной соли.Найдено, %: С 45,58; Н 7,31; И 14,62;С 1 11,86 (ионный); 1 а р (с=1,0, вода);- 42-1-3 (589 ммк); - 44 (578 ммк); - 50(546 ммк); - 91 (436 ммк).ИК-спектр поглощения для хлоргидратаизображен на фиг. 1; ЯМР-спектр для хлоргидрата в диметилсульфоксиде дб - нафиг. 2,Для определения антибиотика применяютбумажную хроматографию (фильтровальнаябумага марки Ватман 1), а также биологический анализ с применением Е. со 1 АТСС10536.Система растворителейн-бутанол: уксусная кислота: вода(2: 3: 4) 0,57Хлороформ: метанол: вода (5: 4: 2) 0,38Хлороформ: метанол: 1%-ная уксусная кислота (5: 4: 2) 0,35Хлороформ: метанол: 0,5 н.Н,О 0,91 Хлоргидрат антибиотика ЕМимеет температуру плавления 180 в 2 С (с разложением), растворим в воде, метаноле, этаноле, диметилсульфоксиде и уксусной кислоте, не растворим в ацетоне, этилацетате, эфире и ацетонитриле.Продукт гидролиза образца (2,30 мг) хлоргидрата антибиотика ЕМ, продуцируемого по описанной методике, получают нагреванием этого антибиотика в 6 н. растворе соляной кислоты при 110 С в течение 16 час. Анализ по известному способу Штейна - Мура показал присутствие лейцина (3,95 моль) и 2,4-диаминомасляной кислоты (7,35 мкмоль). В продукте гидролиза обнаружен также фенилаланин (0,86 мкмоль), а также следы других аминокислот. Продукт9содержит идентифицируемое количество треонина, что служит для отличия антибиотика ЕМот других антибиотиков пептидного характера, например, циркулина, полимиксинов и полипептина. Из продукта гидролиза можно выделить неидентифицированную жирную кислоту, что показывает присутствие примерно 10 вес, Щ этой кислоты в антибиотике. Спектр ультрафиолетового поглощения хлоргидрата в 0,05 н. растворе соляной кислоты показывает наличие небольшого пика при 248 ммк (Е =25) и конечную адсорбцию. Интенсивность адсорбции при 248 ммк усиливается окрашенными примесями, что дает повышение пика поглощения также и в видимой области спектра. Этот пик и конечная адсорбция являются (по крайней мере частично) следствием наличия фенилаланина.П р и м е р 7. Хлоргидрат антибиотика ЕМпревращают в свободное основание противоточным распределением с применением системы, содержащей н-бутанол и 0,5 мл раствор Н 40 Н 1,01 г хлоргидрата антибиотика ЕМ, полученного по методике, описанной в примере 6, подвергают 29-кратному переносу с применением 40 мл верхней и нижней фазы в пробирку. Содержимое пробирок 25 - 29 соединяют, верхнюю фазу отделяют и упаривают досуха под вакуумом. Остаток затем растворяют в теплом метаноле (примерно 50 мл), Добавляют этилацетат (50 мл), бензол (50 мл) и циклогексан (50 мл). Удаляют эту смесь растворителей под вакуумом и получают 0,75 г беловатого порошка, представляющего собой свободное основание антибиотика ЕМ, Температура плавления полученного антибиотика 245 в 2 С. Найдено, : С 56,64; Н 8,65; К 16,50; С 1 0,0.Молекулярный вес свободного основания определяют в этаноле посредством ультрацентрифугирования. Он составляет примерно 1080. Эквивалентный вес, определяемый титрованием хлорной кислотой, составляет 272. Эмпирическая формула антибиотика ЕМв виде свободного основания соответствует примерно С 5,Н 9,М 19012.Спектр ультрафиолетового поглощения, определяемый в метаноле, имеет дополнительно к сильному концевому поглощению следующие пики.Хмнс (Е"), ммк;2475 (плато, 5,8), 252 (плато, 4,5), 258 (4,1), 265 (3,4), 268 (3,2).ИК-спектр в КВг изображен на фиг. 3. ЯМР-спектр в диметилсульфоксиде д, - на фиг. 4.Раствор хлоргидрата антибиотика ЕМв воде (0,1 - 10 мг/мл) обрабатывают растворами солей натрия и калия (0,5 мл). Соли следующих анионов не образуют осадка: ОАс Н Р 042 3 С 103 С 2042 Вг В 407 - 10 з - . Следующие анионы образуют осадки в возрастающей степени растворимости: 042- Мо 042 - НР 04- Сг 04 - Ее (СИ)64 - ге (СЯ) з-, Сг 02 - %0 25 1 О 15 20 25 зо 35 40 45 50 55 60 65 10П р и м е р 8. Антибиотик ЕМможно также осаждать из водного раствора в виде соли с различными арилсульфокислотами путем обработки кислотой или соль кислоты.1,00 г хлоргидрата антибиотика ЕМрастворяют в 50 мл воды и добавляют раствор 1,25 г п-фенилазобензолсульфокислоты в 20 мл воды. Смесь перемешивают в течение 30 мин и выдерживают для отстаивания. Верхний слой декантируют и осадок промывают дважды по 30 мл воды, а затем фильтруют. Осадок высушивают под вакуумом и получают 1,43 г аморфного твердого вещества. Полученную твердую соль п-фенилбензолсульфокислоты кристаллизуют из метанола, Образец перекристаллизовывают 4 раза из смеси метанола с ацетонитрилом (2: 1) и получают продукт, разлагающийся при температуре примерно 267 С при быстром нагревании под вакуумом, Полученный продукт высушивают в течение нескольких часов под давлением 0,02 мм рт. ст. и 100 С и получают повышение веса на 4,17 за счет атмосферной влаги.Найдено, Д: С 53,29; Н 6,42; И 13,10;0 21,33 (по разнице); 5 5,86.Для молекулярного веса 2103 (определенного исходя из наличия четырех атомов серы) анализ соответствует формуле С 97 Н 130112102454П р и м е р 9. Смесь 30,8 мг хлоргидрата антибиотика ЕМ, 1 мл н-бутанола, 1 мл метилэтилкетона, 0,2 мл 1 М раствора 2,4 динитрофторбензола в толуоле и 2 мл 10% раствора бикарбоната натрия перемешивают при комнатной температуре в течение 1,7 час. Верхнюю фазу отделяют, а нижнюю фазу промывают несколько раз этилацетатом. Соединяют верхние фазы, а промывные жидкости и растворители удаляют под вакуумом. Остаток растворяют в минимальном количестве метилкетона, осадок удаляют центрифугированием и отбрасывают. Верхний слой обрабатывают досуха в потоке азота. Остаток растворяют в небольшом количестве ацетона, и продукт осаждают добавлением бензола. Твердое 2,4-динитрофенилпроизводное промывают несколько раз бензолом и высушивают под вакуумом. Получают 36,1 мг желтого порошка. Анализ с использованием тонкопленочной хроматографии на силикагеле после элюирования смесью метанола с хлороформом (1: 9) дает одно чистое пятно (Ю 0,51).Материал подвергают очистке с применением тонкослойной хроматографии и такой же системы растворителей. Собирают желтую ленту с величиной Ю 0,52 - 0,68. Продукт вымывают из силикагеля смесью ацетона и ме. танола (1: 1) и превращают в порошкообраз. ное состояние (30,4 мг) осаждением из ацетонового раствора бензолом. УФ-спектр поглощения в метилэтилкетоне дает Х 352 ммк, Е=398. Образец высушивают при 100 С и давлении 0,02 мм рт. ст. и доводят до постоянного веса атмосферной влагой.5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11Найдено, /О: Н,О 1,04; С 52,02; Н 6,13; И 16,61; О 25,24% (по разнице). Для молекулярного веса 1744 это соответствует эмпирической формуле С 7,Н,о:КО 7.П р и м е р 10. 1,00 г порошка, не растворимого в ацетоне, полученного по методике, описанной в примере 5, растворяют в 10 мл воды. Нерастворимую часть удаляют центрифугированием, промывают 10 мл воды и промывные жидкости соединяют.1,00 г метилоранжа суспендируют в 15 мл воды. Добавляют 5 мл диметилформамида, и смесь нагревают до растворения метилоранжа, Этот теплый раствор добавляют к раствору антибиотика ЕМ. Смесь охлаждают до комнатной температуры, и осадок выделяют центрифугированием, промывают трижды по 35 мл воды и высушивают под вакуумом,Неочищенный гелиантат растворяют в 3 мл диметилформамида и нерастворившуюся часть удаляют центрифугированием, промывая ее дважды по 3 мл диметилформамида. Соединенные растворы диметилформамида соединяют с 90 мл воды, осадок выделяют центрифугированием и промывают трижды по 30 мл воды.Гелиантат антибиотика ЕМпредставляет собой аморфное вещество, которое можно очистить перекристаллизацией из смеси метанола с ацетонитрилом (2: 1). Полученный продукт высушивают под давлением 0,02 мм рт. ст. и 100 С в течение 18 час, а затем доводят до постоянного веса атмосферной влагой. Температура плавления в горячем состоянии по Кофлеру: 242 - 244 С (с разложением).Найдено, %: С 53,01; Н 6,74; К 14,19;5 5,44 (вода 5,05%). Для молекулярного веса 2238 элементарный анализ соответствует эмпирической формуле Сю 4 Н 44 Ыг 4 О 44Гелиантат антибиотика ЕМпревращают в хлоргидрат перемешиванием с 10 мл 0,36 н. раствора соляной кислоты в течение 20 мин. Нерастворимый материал удаляют центрифугированием и промывают дважды по 5 мл 0,36 н. раствора соляной кислоты. Соединенные верхние слои жидкости затем перемешивают с 320 мг активированного угля марки Дарго С - 60 и фильтруют через диатомовую землю с образованием почти бесцветного раствора,Фильтрат экстрагируют дважды по 10 мл н-бутанола. После удаления бутанола под вакуумом получают аморфное твердое вещество, Это вещество превращают в тонкоизмельченный порошок растворением в небольшом количестве метанола, добавлением этилацетата до осаждения антибиотика с последующим удалением смеси растворителей под вакуумом. Порошок затем высушивают при 50 С и 0,02 мм рт, ст, в течение нескольких, например пяти, часов, а затем подвергают воздействию атмосферной влаги в течение ночи. 12Прим ер 11. Раствор 500 мг хлоргидрата антибиотика ЕМ, полученный по методике примера 10, растворяют в 5 мл воды и хроматографируют на колонне размером 2,5 Х 60 см, заполненной целлюлозой марки Ватман СМ(натриевая форма карбоксиметилцеллюлозы), выдерживаемой при 50 С, со скоростью потока 75 мл в час, Колонну элюируют 0,15 н, раствором хлористого натрия, собирая 600 небольших фракций (примерно по 24 мл). Размер вытекающих фракций определяют по поверхностному натяжению, так как антибиотики снижают поверхностное натяжение так, чтобы стекающие с постоянной скоростью фракций, содержащие антибиотики, имели уменьшенный объем. Зависимость объема фракции от всего объема алюированного антибиотика - обратная. Элюирование продолжают (примерно 161) до элюирования трех веществ, названных ЕМальфа, ЕМбета и ЕМгамма. Колонну затем элюируют 0,2 н. раствором хлористого натрия для элюирования четвертой фракции, показанной на графике поверхностного натяжения, обозначаемой ЕМдельта. Фракции, содержащие, соответственно, ЕМальфа, бета, гамма и дельта соединяют, Каждую фракцию экстрагируют 50 (от ее объема) н-бутанола. Бутанольные экстракты промывают дважды равными объемами 0,36 н. раствора соляной кислоты, а затем упаривают досуха.Каждый из перечисленных остатков растворяют в метаноле, осаждают этилацетатом, промывают этилацетатом и эфиром, высушивают при 75 С и 0,02 мм рт. ст. в течение 1,5 час, а затем подвергают воздействию атмосферной влаги для равновесия, оставляя на ночь.Анализ каждой фракции, полученной в виде хлоргидратов, показал следующие результаты (табл. 1),Ооразцы фракций ЕМальфа, бета, гамма и дельта подвергают гидролизу в 6 н. растворе соляной кислоты при 110 С в течение ночи, Каждый гидролизат экстрагируют эфиром с целью удаления жирных кислот. Остаток применяют для анализа аминокислот.Аминокислотный анализ фракций показал, что фракции ЕМальфа и бета отличаются от фракций ЕМгамма и дельта по остаткам аминокислот следующим образом (табл. 2). ИК-спектры каждой из перечисленных фракций изображены соответственно на фиг. 5 - 8. Каждая такая фракция, так же как и хлоргидрат антибиотика ЕМ, растворима в воде, метаноле, этаноле, диметилсульфоксиде и уксусной кислоте и не растворима в ацетоне, этилацетате, эфире и ацетонитриле. Каждая из этих фракций образует соли такого же тина, как антибиотик ЕМ.Мол, весв фракция Н,О 1203 1190 1250 1267 5,84 8,91 8,86 7,09 С 4 вНвИдзС 140 дз СздНвв 1 ч дзСдОдз СввНвд 1 зС 4 Одв Сз,НвбмдзС 1 зОдв 11,85 11,06 10,64 10,58 ЕМальфаЕМбета 8,16 7,85 6,96 7,17 42,96 43,49 43,42 44,75 13,41 13,68 12,92 13,13 ЕМгамма ЕМдельта в Мол. вес и брутто-формулы приведены в расчете на без водные веществ а,Таблица 2 Остаток на молекулу Фракция фенилала 2,4-ДАБНИ Лейцин нин ЕдЧальфаЕМбетаЕМгаммаЕМдельта в 2,4-Диаздиномасляная кислота. Эфирные экстракты гидролизатов содержат жирные кислоты, отщепляемые из антибиотика. Их обрабатывают диазометаном с образованием сложных метиловых эфиров. Полученные метиловые эфиры оценивают методом газовой хроматографии, 5 Кирные кислоты, выделенные из фракции ЕМальфа, отличаются от жирных кислот, выделенных из фрдкции ЕМбета, а жирные кислоты, выделенные из фракции ЕМгамма, отличаются аналогичным образом от фракции ЕМдельта.Две фракции ЕМальфа и бета можно отличать от фракций гамма и дельта по небольшому пику при 696 смв ИК-спектре последней пары фракций, что характеризует присутствие остатка фенилаланина. Аналогично УФ-спектр для пары фракций гамма и дельта имеет характерный пик поглощения, свойственный остатку фенилаланина, между 245 и 270 ммк и такой характерный рисунок спектра отсутствует в спектре поглощения ультрафиолетовых лучей для пары фракций альфа и бета.П р и м е р 12, 70 г порошка, не растворимого в ацетоне, полученного по методике, описанной в примере 5, экстрагируют дважды по 200 мл воды (рН 7,5) и бутанолом. Водные слои, не обладающие антибиотическими свойствами, отбрасывают. Бутанольные слои соединяют и экстрагируют 4 раза по 200 мл воды, насыщенной бутанолом при рН 1,0. Соединенные водные экстракты содержат 5 10 15 20 25 30 35 40 45 наибольшее количество активного материала состоящего из антибиотика ЕМи малоподвижной фракции (МПФ). Водный экстракт концентрируют под вакуумом до состояния сиропа и осаждают ацетоном. Вес полученного порошка, не растворимого в ацетоне, составляет примерно 15 г.Антибиотик ЕМи малоподвижную фракцию сначала грубо разделяют растворением 15 г твердого вещества в 30 мл метанола и пропусканием этого раствора через колонну, заполненную дпэтиламиноэтилцеллюлозой (4,5(60 см) в метаноле, После окончания выхода из колонны окрашенного раствора элюируют МПФ 2%-ным раствором уксусной кислоты в метаноле. Собирают фракции объемом примерно 50 мл до прекращения вытекания из колонны активных веществ, что определяют испытанием с применением дисков в отношении Е, со 11 (Я С 2927) на агаровых пластинах. Фракции затем подвергают анализу посредством тонкопленочной хроматографии на листах из кремневой кислоты по Гельману с применением системы растворителей; бутанол: изомасляная кислота: пиридин: вода (40: 9: 4: 10), а также биологически на агаровых пластинах, засеянных Е. со 11. Фракции, содержащие МПФ (И=0,15), соединяют и концентрируют досуха с получением примерно 5 г. Это твердое вещество затем подвергают распределительной хроматографии на смеси кремневой кислоты с целлюлозой (2: 1 по весу, размер колонны 360 см) с применением того же растворителя, что при тонкослойной хроматографии, На этой колонне происходит разделение фракций ЕМи МПФ, их подвергают анализу путем тонкослойной хроматографии. Снова соединяют нужные фракции и.упаривают их досуха, получая примерно 800 лг остатка. Для дальнейшей очистки соединен дя операцию распределительной хроматографии повторяют. Образец растворяют в смеси ацетона и метанола (1: 1) и пропускают через колонну с Сефадексом 1.И 20, которую пропитывают и заполняют тем же растворителем, При проявлении тем же растворителем можно заметить отдельные полосы. МПФ не вытекает с первыми порциями растворителя. Фракцииснова440847 Таблица 3 Активность, мг/мл Микроорганизм 15 4,7 0,6 0,8 0,6 2,4 12,5 6,3 2,4 50,0 25,0 6,3 37,5 15подвергают анализу путем тонкослойной хроматографии и фракции, расположение пятен у которых соответствует МПФ, соединяют и упаривают досуха. Общий выход составляет примерно 150 мл. Продукт имеет желтый цвет, не плавится до 310 С, от 270 С изменяет цвет до коричневого,Кристаллическую соль Рейнеке этого образца получают растворением 100 мг готового продукта в 5 мл воды, после чего доводят соляную кислоту до рН 2 - 3. Затем добавляют по каплям насыщенный водный раствор рейнеката аммония цо прекращения выделения осадка. Жидкость центрифугируют, и осадок промывают однократно 5 мл воды. Затем осадок высушивают и перекристаллизовывают из 50 мг смеси ацетона с гексаном. Кристаллический рейнекат МПФ представляет собой порошок красного цвета, не растворимый в воде, но хорошо растворимый в ацетоне и метаноле. Он не дает четкой температуры плавления, но разлагается при 198 в 2 С, Испытания на цветные реакции показали следующие результаты: нингидрин ( в ), антрон ( в ), гидролизат на нингидрин (+).Антибиотик ЕММПФ показывает конечную абсорбцию в УФ-спектре (см. фиг, 9).Найдено, /о: С 50,46; Н 6,47; И 11,69, нейтральный эквивалент=584.Для молекулярного веса 12000 элементарный анализ соответствует формуле СвОНиХ 10024.Гидролизат получают гидролизом 2,012 мг антибиотика в 6 мн. растворе соляной кислоты при 110 С в течение 17 час и подвергают анализу на содержание аминокислот, которые присутствуют в следующих количествах, моль:2,4-Диаминомасляная кислота 1,74 КН 40 Н 1,01 Треонин следы Серии 0,84 Глутаминовая кислота следы Алании 0,51 Валин 0,82 Лейцин 0,45 Фенилаланин 0,47 Тирозин следы Кристаллический рейнекат антибиотика ЕММПФ имеет температуру плавления 198 - 200 С (с разложением), а УФ-спектр имеет максимум поглощения при 240 ммк (Е =450) и 315 ммк (Е" =350). 16Полученный рейнекат не растворим в водеи растворим в ацетоне и метаноле.Пример 13. Двухкратные испытания наразбавление в пробирках для некоторых ми кроорганизмов дали следующие результаты.Антибиотик ЕМприменяют в данных опытах в виде хлоргидрата, и его чистота соответствует светло-бурому порошку, описанному в примере 6 (табл. 3).10 Я 1 арйу 1 ососсцз ацгецз ГДА 209 РЯ 1 гер 1 ососсцз руодепез С 203ЕвЬег 1 сЫа соИ АТСС 1053620 ЕзЬег 1 сыа СОИ ЯС 8294 еРзецдогпопаз аегц 81 пова ЯС 8329 фСапйЫа а 1 Ысапз ЯС 5314 фСапййа 1 гцве 1 ЯС 2616 фЯассйаготусез сеге 1 в 1 ае ЯС 1600 ф25АврегИ 111 цв п 1 дег ЯС 2828 фРцваг 1 цгп Ьц 1 Ыиепцт ЯС 5273Тг 1 сЬорйугоп тепгадгорйу 1 ез ЯС 2637 фТг 1 сИотопаз таи 1 паИв ЯС 8660 ф30 ф Организмы из коллекции культур Сквибба. Пример 14. Для испытаний 1 п тсо мы шам вводят внутрибрюшинно 100 доз 1-РзоЯгер 1 ососсцз руодепез С 203, Испытания показали, что выжило только 50% мышей при введении всего 120 мг/кг антибиотика ЕМв виде хлоргидрата подкожно в два приема: 40 через 1 час и через 5 час после заражения,В контрольной группе мышей, не получавших антибиотика, выживших мышей нет.П р и м е р 15. Аналогично, при введениимышам внутрибрюшинно 500 до П)зо штам ма микроорганизма Езйег 1 сЫа со 11 ЯС 8294,суспендированного в 5% муцина, выделенного из свиного желудка, 50% мышей выжило при подкожном введении антибиотика ЕМв виде хлоргидрата в количестве 50 мг/кг 50 через 1 час после заражения, Все мыши, неполучившие антибиотика, погибли.П р и м е р 16. Испытания на двукратноеразбавление в пробирках с указанными микроорганизмами дали следующие резуль.55 таты (табл, 4).440847 18Таблица 4 Активность, мг/мл ЕММикроорганизм бета альфа МПФ гамма дельта Предмет изобретения нием целевого продукта из фильтрата культу- ральной жидкости и хроматографическим разделением его на активные компоненты, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве продуцен та целевого продукта используют штаммВас 111 цз с 1 гсц 1 апз АТСС 21656. 4000 3500 3000 2500 О 00 7800 Iб 00 7400 7 О 0 (000 ЮО бР 5 Риг. 1Бгарйу 1 ососсцз ацгецз 209 Р81 гер 1 ососсцз руодепез С 203Ейег 1 сЫа со 11 ЯС 2927Езйег 1 сЫа соИ ЯС 8294Рзецдотопаз аегцфпоза ЯС 8329Сапййа а 1 Ысапз ЯС 5314Тг 1 сЬотопаз чафпа 11 з БС 8560 Способ получения антибиотика путем культивирования культуры Вас 111 цз с 1 гсц 1 апз в аэробных условиях, в водной питательной среде, содержащей источник углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделе 12,51,6 0,6 0,4 0,8 9,450,0 6,3 0,8 0,6 0,3 0,8 9,4 25,0 3,1 0,4 0,6 0,3 0,4 6,3 37,5 2,4 0,4 0,4 0,3 1,2 4,7 25,0 753,1 1,612,5100,0 25,0