Реагент для индикации микроорганизмов

(19) и 1) А ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯн двтоЕСнОмУ СеидктюьСтвую щ и й с я тем, рения определения, тетразолия в вивора в этиловом ельно содержит потрехзамещенный стиллированную восоотношении комполия,. отлича что, с целью уско он содержит соль де 2-9-ного раст спирте и дополнит лиэтиленгликоль, фосфат калия и ди ду при следующемнентов вес,ч,г Полиэтилен- . гликоль Трехзамещенный фосфат равочник поирусологическимМ 1967,2 17-28 е ки-,икаторело",2-9 раствор соли тетразолия в этиловом спирте Дистиллированная вода 0,51-0,55 С:Остальное УДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического прборостроения(54)(57) РЕАГЕНТ ДЛЯ ИНДИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ по их дегидрогеназнойактивности на основе соли тетразо(51) С 12 Я 1/04, С 121/32200 200 200 и и и 200 200 Таблица 8 ремя повления изуально аблюдаемой окрас- и, мин Концентрация не тетразоли."хлоридавесч,рН трехзамещенногофосфатакалия полиэтиленгликоля1 10 1 10 6,2 0,03 22 25 1 10 Вид микроорганизмов Е. союз. М 17 Яаг. 1 ача БассЬ. сегея 1 ае Вас. сегежка Вас. 1 йчглдепвя Вид микроорганизмов Е,со 21 М 17 Состав двухфазной системыКонцентрация,вес.ч, онцентрация неотетраэолия хлорида,вес.ч. 0,01 6,2 8 10 8 10 8 10 Концентрация микроорганизмов кл/мп ремя появления визуально наблюдае. мой ок.раски, мин.ч. полиэт ленгли коляв 0,0 2 2 0 1. 105 1 10 аг.ГМ 100 1 10 100,соМх М 17 став двухфазно системы рехзамеенного Фосфата калия Конц трац неот разо хлор Концея трация микроо ганизм кл/мл ремя повленияизуальо наблюаемойкраскимин21 10 б 3835 с 22 Продолжение табл.9 Бассп,сегеч 1 н 1 ЪО б 4 10 1 10 сегецв 18 10 П пдепе 1 в 0 Вас Со ст ав и тель О, Техред Л,Микеш о тор И. Ковальчу е исно ак4/5 4 0472/27 Тираж 523 вНИИПИ Государственного комитета СС по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., илиал ППП "Патент", гУжгород, ул. Проек ваКорректор А.ППоставленная цель достигается тем, что реагент для индикации микр 5 организмов по их. дегидрогеназной активности на основе соли тетраэолия содержит соль тетразолия в виде 2-9 Ъ-ного раствора в этиловом спирте и дополнительно содержит полиэтиленгликоль, трехэамещенный фосфат калия и дистиллированную воду при следующем соотношении компонентов, вес,ч.: 40ПолиэтиленгликольТрехзамещенныйфосфат 45калия2-9-ныйраствор солитетразолияв этиловомспиртеДистиллированнаявода ОстальноеВключенная в состав реагента (в виде спиртового раствора) соль тетраэолия играет роль индикатора реакции, осуществляемой дегидрогенаэами микроорганизмов, по которой и судят об их наличии, Полиэтиленгликоль и трехзамещенный фосфат калия в дис- Ю тиллированной воде образуют двухфазную систему, которая играет роль фона, на котором выявление микроорганизмов происходит особенно четко. Бактерии, внесенные в систему, соби 20-30 17-28 0,51-0,55 Изобретение относится к микро. биологии и медицине, в частности креагентам для обнаружения микроорганизмов в жидкости.Известно средство обнаружениябактерий по редуктазной активности 5на основе ре акции обе спечи вани я мети.ленового синего в присутствии исследуемой пробы при 38-40 Г. Регистрация наличия бактерий в пробеосуществляется визуально по обесцвечиванию окраски пробы (1 .Наиболее близким по техническойсущности к предлагаемому являетсяреагент для индикации микроорганизмов по дегидрогеназной активности,состоящий из носителя - бумаги, пропитанной хлоридом 2,3,5-трифенилтетраэолия и питательной средой.При использовании его смачивают анализируемой жидкостью и инкубируютв течение 12-14 ч. В случае наличиямикроорганизмов возникает красноеокрашивание 2,Недостаток известного реагентадлительное время анализа из-эа необходимости подрадяивания микроорганизмов.Цель изобретения в . уменьшение времени, т.е. ускорение определения,микроорганизмов,30 раются на границе раздела фаз, следовательно, их количество на поверхности раздела фаз увеличивается, чтопозволяет исключить иэ анализа такуюдлительную стадию, как подращивание,а это, в свою очередь, приводит кувеличению скорости взаимодействиябактерий с солями тетразолия и появления видимой окраски, Таким образом, экспрессность достигается засчет использования в индикаторе двухфазной системы. Кроме того, образующиеся при восстановлении солейтетразолия формазаны нерастворимы вводе и остаются на разделе фаз,где находится биоматериал, вследствии чего появляющаяся на границераздела фаэ окраска более контрастнаи становится видной глазу наблюдателя раньше, чем при наблюдении тогоже явления в объеме жидкости. Приувеличении объема пробы соответственно в 10 и 100 раз увеличиваетсячувствительность и соответственноуменьшается время анализа даннойконкретной концентрации микроорганизмов за счет использования в качестве носителя концентрирующей двухфазной системы.При изготовлении предлагаемогореагента для введения соли тетраэолия в систему ее растворяют в этиловом спирте, так как соли тетразолия плохо растворяются в воде, Приэтом на 0,01-0,05 вес.ч. соли берут 0,5 вес.ч, спирта, получая вреэультате 2-9%-ный спиртовой раствор. Данные количества являются необходимыми для обеспечения стабильности двухфазной системы реагента,проявления четкого окрашивания.Оптимальные значения рН, при которых используется предлагаемыйреагент, составляют 6,2-7,0, Этотреагент обеспечивает индикацию микроорганизмов в течение 1-200 мин,т.е. значительно быстрее,чем известный, используемый для этой цели,Экспрессность достигается за счетконцентрирования микроорганизмовв интерфаэе из объема жидкости исоответственно увеличения скоростипоявления окраски эа счет большегоудельного количества микроорганизмов,Использование в индикаторе в качестве носителя концентрирующей двухфазной системы позволяет исключитьдлительную стадию подращивания микроорганизмов,П р и м е р 1. В пробирку иа 25 мл сечением 1 см к 62,79 вес.ч.йисследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов,добавляют смесь, содержащую, вес,ч.: полиэтиленгликоль ЖО, 20, трехэамещенный фосфат калия 17, иоднитротетразолий 0,01, растворенный в 0,5 вес.ч, этилового65 спирта. Систему подкисляют фосфорной кислотой до рН 6,8. После разделения фаз ("-1,5 мин) через 190 мин в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе)наблюдают за окраской в интерфазе. 5Наличие. окраски указывает на присутствие микроорганизмов,П р и м е р 2, В пробирку попримеру 1 к 52,47 вес.ч. исследуеюй водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую вес.ч: полиэтиленгликоль -40025, трехзамещенный Фосфат калия 22иоднитротетразолий 0.003 раство-15ренный в 0,5 вес,ч. этилового спирта, подкисляют систему Фосфорнойкислотой до рН 6,8.После отстаивания 1-1,5 мин)через 0,2-40 мин (в зависимостиот вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают за бкраскойв интерфазе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов,П р и м е р 3. В пробирку по примеру 1 к 41,45 вес.ч. исследуемойводной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов,добавляют смесь, содержащую, вес.ч.;полиэтиленгликоль - 400 30; трехзамещенный фосфат калия 28; иоднитротетразолии 0,05, растворенный в0,5 вес,ч. этилового спирта, подкйсляют систему фосфорной кислотой до рН 6,8. После разделения фаз 35(1-1,5 мин) через 0,6-60 мин (в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают заокраской в интерфазе. Наличие окраски указывает на присутствие микро-.организмов.В табл. 1-3 дано время появленияаналитического эффекта при определении иоднитротетразолий редуцирующейактивности для аэробных микроорганизмов в зависимости от их вида и 45концентрации в пробе соответственнопо примерам 1-3).Из табл, 1-3 следует, что использование в индикаторе в качестве носителя концентрирующих двухфазных 50систем в сочетании с реагентомиоднитротетразолием позволяет проводить определение аэробных микроорганизмов в пробе в зависимости от их .вида и концентрации за 0,2-90 мин. 55П р и м е р 4. В пробирку по примеру 1 к 62,49 вес,ч, исследуемойводной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую вес.ч.: по-ЬОлиэтиленгликоль - 400 20трехзамещенный Фосфат калия 17; тетразолий Фиолетовый 0,01, растворенныйв 0,5 вес.ч, этилового спирта, подкисляют систему 4 Ьсфорной кислотой до рН 7. После разделения Фаз ( 1- 1,5 мин) через 20-70 мин (в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают эа окраской в интерфазе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов.П р и м е р 5. В пробирку по примеру. 1 к Р 2,47 вес,ч, исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид,аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую, вес.ч,: полиэтиленгликоль25; трехзамещенный фосФат калия 22; тетразолий фиолетовый 0,03, растворенный в 0,05 вес.ч. этилового спирта, подкис ляют систему фосфорной кислотой до рН 7. После отстаивания через 5- 50 мин (в зависимости.от вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают за окраской в интерфазе, Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмовП р и м е р 6, В пробирку по примеру 1 к 41,45 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую вес.ч.: полиэтиленгликоль30; трехзамещенный фосфат калия 28, тетразолий фиолетовый - б,05, растворенный в 0,5 вес.ч,. этилового спирта, подкисляют систему фосфорной кислотой до рН 7. После разделения фаз (1- 1,5 мин) через 15-60 мин (в зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают за окраской в интерфазе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов.В табл. 4-6 по примерам 4-6 соответственно дано время появления аналитического эффекта при определении редуцирующей активности тетразолий фиолетового для аэробных микроорганизмов в зависимости от их вида и концентрации в пробе.Как видно из табл. 4-6, использование в индикаторе в качестве носителя концентрирующих двухфазных систем в сочетании с реагентом - тетразолием фиолетовым позволяет проводить определение аэробных микроорганизмов .в пробе в зависимости от их вида и концентрации за 5-90 мин.П р и м е р 7. В пробирку по примеру 1 к 62,49 вес.ч. исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов, добавляют смесь, содержащую, вес.ч.: полиэтиленгликоль20; трехзамещенный фосфат калия 17; неотетразолий хлорид 0,01, растворенный в 0,5 вес,ч. этилового спирта, подкисляют систему фосфорной кислотой до рН 6,2. После разделения фаз (1-1,5 мин) через 5-200 мин (в за1063835 Таблица 1 Состав двухфазной системы Концен,трациямикроорганизмов,кл/мл Концентрация иодни- тротетразолия хлорида,нес,ч. Время появления визуально"наблюдаемой окраски,мин Вид микроорганизмов рН Концентрация,вес,ч.полиэти- ленгликолятрех- заме- щенного фосфата калия 1 101 105 0,01 6,8 Е, со 2 М 17 29 1-3 1 10 30 1 10 Баг, Г 1 ача 0,3 1 10 1 10 1-2 15 висимости от вида и концентрации микроорганизмов н пробе) наблюдают заокраской н интерфаэе. Наличие окраски указывает на присутствие микроорганизмов,П р и м е р 8, В пробирку попримеру 1 к 52,47 нес.ч, исследуемой водной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов,добавляют смесь, содержащую нес;ч.:полиэтиленгликоль25, трехэаме Ощенный фосфат калия 22 неотетразолий хлорид 0,03, растворенный н0,5 вес.ч, этилового спирта, подкисляют систему Фосфорной кислотойдо рН 6,2, После отстаивания через 152-120 мин (в зависимости от вида иконцентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают за окраской в интерфазе. Наличие окраски указывает наприсутствие микроорганизмов. 20П р и м е р 9. В пробирку по при.меру 1 к 41,45 вес.чисследуемойводной пробы, содержащей определенный вид аэробных микроорганизмов,добавляют смесь содержащую вес,ч,:полиэтиленгликоль30, трехзамещенный фосфат калия 28, неотетраэолий хлорид 0,05, растворенный н0,5 вес.ч. этилового спирта, подкисляют систему Фосфорной кислотой дорН 6,2, После разделения фаэ 11,5 мин) через 4-180 мин н зависимости от вида и концентрации микроорганизмов в пробе) наблюдают эаокраской в интерфазе. Наличие окрас-ки указывает на присутствие микроорганизмов,В табл. 7-9 показано время появления аналитического эффекта при определении редуцирующей активности неотетразолия хлорида для аэробных микроорганизмов в зависимости от их нида и концентрации в пробе соотнетственно по примерам 7-9) .Из табл. 7-9 следует, что использование в индикаторе в качестве носителя концентрирующих двухфазных систем в сочетании с реагентомнеотетразолием хлоридом позволяет проводить определение аэробных микроорганизмов в пробе в зависимости от их вида и концентрации эа 2200 мин. Предложенный индикатор позволяет сократить время проведения анализа на присутствие аэробных микроорганизмов н водной пробе до 0,2-200 мин табл;1-2 ) по сравнению с прототипом (720-840 мин) за счет использования в индикаторе в качестве носителя концентрирующей двухфазной системы, что, в свою очередь, исключает длительную стадию подрашивания микроорганизмов. Индикатор не требует дальнейшей разработки и может быть применен в микробиологическом производстве, а также для анализа воды на загрязненность микроорганизмами, внедрение его не требует больших затрат и специального обучения. Технико-экономическая эффективность изобретения заключается н ускорении определения микроорганизмов..8 10 8 104 блица 2 Состав двухфазной системы Концентрация микроорганизмов,мл/мл рн полиэтиленгликоля1 10 0.со 11 М 17 10 0 0,3 1 10 и1 10 И и аг, Г 1 а О,04 И И И Яассй. сегеч 1 в 3. Вас. сегеив Вас. 1 Ьцгп 8 епвв ид микроорганизмов Яассп.сегеч 1 в 1 ае трех- эаме- щенного фосфата ка- лия оцентрация,вес.ч.замещенно го фо фата калия Концентрация иодни- тротетРазолия хлорида вес.ч. Концентрациямикроорниэмов,кл/мп Вреья по" явления визуально"наблюдаемой окраски,мин Время появления визуально наблюдаемой окраски,мин-вееееее1 Концентрация иодни- тротетразолия хлорида вес,ч. Состав двухфазной систеиа Время появления визуально наблюдаемойокраски, мин рН Коцеитрация,вес.ч. юевтют юшющ по,ли эти леигликоля1 106 2 22 0,03 6,8 1-10 1025 110 1 110 5 5 10 30 Вас. сегеця 810 2 8 104 40 Таблица 3 Состав двухфазной системы Концентрация микроорганизмов кл/мл рН Коцентрация,вес.ч.полизти- ленгликолятрех- замещенног фосфата ка- лия 0,05 6,8 1 10 0)661 1051-2 28 Е. союз. М 17 30 1 10 20 1 Яаг, Г 1 ача 110 1 1,104 10 110 1 110 4 00568 410 15 30 28 Вид микрооргани эмов Вас, Фйцг 1 п 1 епая Вид микроорганизмов Бассй. сегеч 181 ае трехэамещенного фосфатакалия онценрация одни- ротетразолия лорида, вес.ч. Концентрация микроорганизмов,мл/мл Время появления ви- зуально на- блюдаемой окраски, мин12 1063835 земя оявл Н вуальноо на- блюдае мой окраски,мин ме нн аа 0 6 0 Т а а онценрацияикроор емя вления р вуальн- аа гани кг/ полиэт ленгли коля7 0 2 3 4 9 ГЛа 5 0 0,104 0,01 0 С, СЕГЕ 1. ас. сегецв Ьцг 1 пц 1 епв 1 в микроорганизмов,Е.со 13. М 1 ассЬ, сегеч 1 в 1 ае став двухфазно системынцентрация, вес.ч. трехзамещенного фосфатакалия Концентрациятетразолияфиолетово го.вес,ч. Продолжение табл. Концеи В трация п микроор- н ганизмов кл/мл в, но , блюда мой о раскимин 110 1 1 10 2Концентрация( вес.ч, рН рехзамещенного фосфата калия полиэзиленгликоля70 15 20 8 10 8 104 70 Таблица 5 Состав двухфазной системы рН Концентрация, вес.ч. 110 10 25 0,03 22 15 1, 104 50 1 10 1 10 40 1 10 4 104 40 22 0(03 25 10 40 Вид микроорганизмов Бас. 1 Ьигп 8 епя 1 я Вид микроорганизмов Е,со 2 х М 17 Баг, Грача 1 Яассп. сегеч 1 я 1 ае Вас. сегеия полиэтиленгликолятрехэамешенно го фосфата ка лия Концентрациятетразолияфиолетовоговес.чКонцентрациятетразолияфиолетового( вес.ч,Концентрация микроорганизмов, кг/мл 5. 1048 10 Концентрация микроорганиз мовкл/мл 1 (106 1 10 5 10 Время появления визуально на блюдаемой окраски, мин ремя ловления иэуальо наблюаемой краски, мин1 б 1063835 Продолжение табл, 5 8 10 5 8 0 оф б л микр рН " ни эмо полиэти ленгликоляи 0 й о 21 М 1 5 5 7 3 20 1 104 7 Яаг,Х 1 0 5 710 сегеч 1 в 1 а 4 10 0,0 0 0 Вас е 510 0 8трехэаме щенного фосфатакалия Концентрациятетразолия фиолетовоговес.ч,Концентрация микроор ганизмов,кл/мл 1 105 108 106 ремяроявлеия виуальо наблюаемоИкраски,