Способ энзиматического превращенияглюкозы bo фруктозу

ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(23) Приоритет - (32) 130375 С 07 6 7/02 С д.З К 1/00 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийДата опубликования описаиия 17. 01. 81 ИностранцыПоуль Берге Росениус Поульсен и Лена Элизабет Эиттан Дания)(72) Авторы . изобретения Иностранная Фирма "Ново Индустри А/С" ( Дания)(54) СПОСОБ ЭНЗИМАТИЧЕСКОГО ПРЕВРАЩЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ ВО ФРУКТОЗУИзобретение относится к способам энэиматического превращения глюкозы во фруктозу и может быть использовано в пищевой и смежных с ней областях.Энзиматическая иэомеризация глюкозы во фруктоэу основана на использовании энэима глюкозоиэомеразы, который активируется в присутствии 10 иОнОВ СО и МдОднако это в значительной степени увеличивает стсимости конверсии сиропа, поскольку любое количество ионов кобальта, добавляемое к исходному глюкозному сиропу, должно удаляться из продукта глюкоза-фруктоза с помощью сравнительно дорогостоящих способов ионного обмена. Ионы магния, который является не настолько токсичным, как кобальт, могут в небольших количествах содержаться в получаемом продукте. Однако уменьшение использования ионов магния в процессе превращения глюкозы во фруктозу 25 также приводит к удешевлению процесса в связи со снижение 1 затрат на очистку получаемого продукта.В настоящее время большинство энэиматических способов превращения Ж; г т312глюкозы во Фруктозу предусматривает проведение процесса в присутствии СОи Мд+.Например, известен способ энзиматического превращения глюкозы во Фруктоэу путем пропускания раствора, содержащего 5-80 вес,Ъ глюкозы и ионы СО и Мд в количестве соответственно 10М и 510 М, через колонку с иммобилизованной глюкозоиэомеразой при 20-85 оС и рН на входев -олонку 6-9. Общее время контакта варьируют в широких пределах, а в качестве иммобилизованной глюкозоизомеразы используют глюкоэоизомеразу Ьегерсовусез ьр. АТСС 21175, иммобилизованную на интертном носителе-анионообменной целлюлозе или анионообменной смоле (размер частиц не указан) 11)Однако получают продукт, содержащий недопустимые примеси используемых ионов Со и Мд. Это вызывает необходимость дополнительно очищать целерй продукт ионообменными способами с использованием дополнительного оборудования и затрат. Кроме того, используемая в способе иммобилизованная глюкозоиэомераэа разрушается под воздействием температуры, при797582 р и о9 = Составитель О. Скородумоваова Техред И.Асталош Корректо в кая Редакт аз иал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проектная,9823/82 Тираж 408 ВНИИПИ Государственного коми по делам изобретений и от 035 Москва ЖРа скаяО которой проводится процесс изомеризации.Осуществление процесса при рН, близком:к 9 при большом времени контакта), вызывает нежелательное окрашивание получаемого продукта, что также является недостатком известного пособа.Цель изобретенная - упрощение процесса и улучшение качества целевого продукта. Укаэанная цель достигается тем,что в способе энзиматического превращения глюкозы во фруктозу используютсироп, содержащий ионы Ид в количестве 10 -10 М, причем содержание Идфвзаимосвязано с концентрацией ионовСа, которые дополнительно содержатсяв исходнрм растворе в количестве10- 10 И, путем следующей зависимости: молярное соотношение концентраций Мд/Са+ составляет 5-500 приконцентрации ионов Ид, большей 1 бЪ,и 5-10 при концентрации ионов Идменьшей или равной 10 М, в качествеиммобилизованной глюкозоизомеразыиспользуют иммобилизованную с помощью 25глутарового альдегида глюкозоизомераэу Вас. соадц 1 апв с размером частиц0,01-1 см, и процесс ведут непрерывноПредпочтительно концентрация ионов З 0Мд составляет 10 -5 х 10 М, а ко- %центрация ионов Са составляет 10 2,5 х 10 М и пр соотношении концентраций Ид/Са (5-10):1.Обычно в процессе используют раст- З 5 вор глюкозы с концентрацией 40- 45 вес.Ъ, время контакта исходного раствора с иммобилизованной глюкоэоизомеразой составляет 10 мин - 2 ч, а процесс предпочтительно ведут при60-70 оС. 40Таким образом, предпочтительное осуществление способа включает обработку с помощью такого небольшого количества добавляемогмагния, что последующий изомеризационный ионный об мен можно устранить.В процессе используют иммобилизованную глюкоэоизомеразу, полученную иэ клеток Вас, соадц 1 апв, которая отличается стабильностью и высокоактив ностью. Конкретно, в качестве препарата иммобилизованной глюкоэоизомеразы используют клетки микроорганизмов Вас. соадцабо, поперечно сшитые с глутаровым альдегидом, которые подвер: гают значительной деструкции. Предпочтительно препарат энзима получают из клеток, которые подвергались гомогенизации до начала реакции с глутаральдегидом.Способ получения ферментативно ак тивной, физически стабильной, водо- нерастворимой глюкозоизомеразы из клеток микроорганизмов Вас. соадц 1 апь включает концентрирование и гомогенизацию клеток микроорганизмов с полу- д чением гомогенизированного концентрата клеток, содержащего разрушенныеклетки, и с сухим содержанием вещест-.ва З-ЗО вес,Ъ, взаимодействие указанных клеток концентрата с 0,011,0 вес.ч. глутаральдегида на частьсухого вещества для создания такимобразом связанного твердого продуктаи удаление после этого воды и измельчение этого связанного продукта. Способ получения глюкозоиэомеразы, включает культивирование в аэробных условиях атипичных Вас, соадц 1 апь, продуцирующих гчюкозоизомеразу, причем указанные Вас. соадц 1 апь способны расти лишь на неорганических источниках азота в качестве источников азота при 65 С на питальнойсреде, соодержащей источник азота, источник углерода, при возможном включении ксилозы, небольшие количества неорганических солей, при рН 5-9 и температуре 40-65 С, после чего выделяют полученную таким образом глюкозоизомеразу.Биохимические потребности иммобилиэованных энзимов изомеразы глюкозы из Вас. соадц 1 апь в кобальте могут полностью удовлетворяться без добавки кобальта в процессе изомеризации. В результате исключения Со из глюкозного сиропа производительность процесса изомеризации и стабильность энзима не ухудшаются, а в некоторых случаях улучшаются. Биохимические потребности энзима глюкозоизомеразы в магнии намного меньше, чем полагали ранее. Фактически добавление Ид можно вообще устра+2.нить, если концентрация Сафявляется низкой, Потребности активации изомеразы глюкозы ионами Ид+ полностью удовлетворяются при рН 7,8 или более при использовании менее 10М Мд+.Ионы кальция в сиропе являются ингибиторами, .вероятно, в большей степени, чем было установлено .до сих пор. Очевидно роль ионов Мд в сиропе сводится большей частью к тому, чтобы препятствовать ингибированию Са . Низкое содержание кальция в сиропе позволяет снизить содержание.омагния. Отношение Ид /Са - в сиропе должно превышать 5:1 в мольном соотношении, преимущественно это отношение должно превышать 10:1, ноне 500:1, если концентрация ионов Мд( ( 10 М.Протекание реакции энзиматическойиэомеризации глюкозы при рН более 8,0 вызывает окрашивание продукта, Этого избегаютпри обычной изомеризации, проводимой при рН ниже 8,0, с целью уменьшения цветообразования.Удаление окраски полученного сиропа, например, путем обработки активированным углем входит в стоимость об " работки. Однако степень окрашивания.глюкозного сиропа увеличивается с увеличением рН.Исследование тенденции к окрашиванию показывает, что скорость окрашивания при всех уровнях рН является функцией времени. Короче говоря, бо,лее высокая скорость скрашивания при 1 рН 8,0 может нивелироьаться более быстрой изомеризацией, В результате ограничения общей выдержки или времени контактирования глюкозного сиропа в реакторе энзимной конверсии до 10 менее 3,5 ч получают сироп подходящего цвета.Если продолжительность контактирования ограничивается менее, чем 1 ч, то обработку с целью поглощения 1 окраски получаемого сиропа можно не. проводить. Таким образом, предлагаемый способ обладает следующими особенностями; для иэомеризации не добавляют Со+, для изомериэации нет необходимости добавлять М 9 " в больц ших количествах, не требуется проведения ионного обмена после изомеризации с целью удаления вредных ионов, энзим обладает отличной теплостойкостью, производительность способа улучшается, способ пригоден для непрерывной работы колонны, падение давления на единицу длины колонны является небольшим, уровень конверсии составляет 40-45. ЗОИтак, способ заключается в проведении изомеризации глюкозного сиропа в виде непрерывного процесса при рН подаваемого сиропа в интервале 7,8-8,6 с продолжительностью контак тирования менее 3,5 ч, предпочтительно, менее 2 ч. При непрерывном процессе 30-55 Ъ вес/вес) глюкозного сиропа превращается в сироп, содер-. жащий желаемый уровень фруктозы, по 40 крайней мере 40, обычно около 45%. Температура конверсии составляет 60-85 ОС, предпочтительно 60-7(РС. Интервал рН 7,8-8,6 поступающего сиропа поддерживается .путем регулирования щелочью (МаОН или МаСО 3) и, если 45 необходимо, путем повторного регулирования .в избранных точках в реакторе конверсии. р 11 изомериэованного выходящего сиропа является более низким, чем рН входящего сиропа. Обычно раз ница между рН входящего сиропа и рН выходящего сиропа составляет от 0,2 до 0,6. Регулирование рН важно при осуществлении предложенного способа. Если РН слишком высокий, например 55 выше л 8,6, то происходит нежелаемое окрашивание (осли продолжительность контактирования большая). Если рН является слишком низким, например ниже 7,6, то добавление Со+12 необходимо для поддержания активности энзима.Оптимальная величина рН для энзима из Вас. соа 901 апь составляет 8,5. Промышленный периодический процесс обычно осуществляется при прслолжнтельном времени контактирования вследствие использования сравнительно небольших концентраций энзима. По этой причине рН следует поддерживать низКим во избежание окрашивания и активность энзима при этом рН будет значительно меньше, чем при оптимальном рН, Необходимо добавление Со . При .непрерывном способе продолжительность контактирования может поддерживаться небольшой и рН может быть высоким. Иэомеризацию можно осуществлять при очень близком к оптимальному значению рН энзима. Со "можно н добавлять. Таким образом, непрерывный способ обладает преимуществами по сравнению с периодическим процессом.Количество И 9 , добавляемое к подаваемому сиропу, составляет менее д-.10 М, предпочтительно менее 5 х 10 " И. Однако, допуская низкие уровни Муфт, следует контролировать содержание кальция в поступающем сиропе до менее 1 -40 М, что, например, можно сделать при образовании сиропа из воды с малым содержанием кальция или путем соответствующей обработки глюкозного сиропа с целью ограничения кальция до менее 2,5 х 10 В М. Во всяком случае, Если присутствует кальций, то к сиропу добавляют достаточное количество магния для создания избытка ионов Иу по отношению к содержанию кальция в нем до молярного отношения И 9 /Са+ более 5:1, предпочтительно более молярного отношения И 9 /Са 10:1.+Е .Я Содержание И 9 и Са контролируется и регулируется таким образом, чтобы в результате удаления Са с помощью ионного обмена из глюкозного сиропа, если необходимо, избежать получения концентрации ионов.Са+ в количестве, большем 10 М, а ионов И 9" - в количестве, большем 10 . Если в глюкоз ном сиропе содержится более низкая концентрация Са+, то добавляемое количество Иц может умейьшаться в со+2ответствующем отношении, таком, что И 9 Са подперживается в интервале 5-500 для Ид+, большем 10 , и является более высоким, чем 5 для И 9 ЙО "М (см. чертеж) . Та им образом, предпочтительно в сиропе содержится менее 2,5 х 10 М Саи 5 х 10 М М.Практически глюкозные сиропы, которых касается изобретение, получают из гидролизата крахмала. Часто получение сиропа начинается путем суспендирования крахмала в жесткой воде проводной воде, и поэтому там находится Саф.Ч:то гидролиз крахмала и осаха ривание гидролиэата крахмала про 1/ водятся энзиматически, используя Саактивированные. эн зимы, 11 оэтому Са редко отсутствует в глюкозных сиропах 1 помимо тех, которые получают в лабораторных условиях непосредственноиз кристаллической декстроэы с помощью деионизированной воды), нужноследить за тем, чтобЫ содержание Сае.юе превышало 10 М.При непрерывных процессах изомеризации практический размер частицэнэима определяется условиями обработки сиропа (и оборудования). Для.способа с использованием колонны, который является предпочтительным дляизобретения, частицы более 100 рявляются предпочтительными (поскольку колонна склонна к засорению, еслииспользуются маленькие частицы/, Впроцессах с использованием тонкогослоя (например,. иэомеризация в реакторе с фильтр-прессом) можно использовать частицы любого размера.В нижеследующих примерах конкретного осуществления изобретения активность иммобилизованного энзима измеря щ 0ется в единицах СС (международнаяединица), 1 СС определяется количеством энзима, который катализируетизомеризацию глюкозы во фруктозу с, начальной скоростью 1 р/моль/мин приобычных условиях, т.е. при 40 вес.Ъглюкозы, рН 8,5 на входе, 65 С ио4 х 10 5 М Ицбез Са, в колонне с непрерывным уплотненным слоем, размерколонны 2,5 х 40 смВ примерах производительность эн- З 0зима за указанное время (ч) определяется в виде количества глюкозы вкг, которую мбжно превратить в смесьфруктозы и глюкозы со степенью конверсии 0,45 на кг энэима с начальной 35активностью 100 ОС/г.. Используете препараты энзима обладают.активностью от 150 до 250СС/г. Для сравнения результатов изпрепаратов с различной активностью 40все величины производительности пересчитывают на энзим с активностью100 6 С/г.В примерах продолжительность контактирования соответствует получениюэнзима с активностью 100 6 С/г. Например, продолжительность контактирования 1 ч с получением энзима активностью 200 ОС/г соответствуетпродолжительности контактирования 2 чс обычным получением активности100 ОСlг.П р и м е р 1. Изомеризацня в приФ"1сутствии и отсутствии СоВсе иэомеризации проводят в виде непрерывных реакций в потоке с использованием заглушек в виде уплотненнойнасадки.Энэим Вас. соао 01 апь получают следующим образом.1. Приготовление концентрата и егоиммобилиэация.Культивируют клетки Вас. соацц 1 апь штамма МВ 8 В 5656, затем клетки выделяют из ферментационного бульона путем центрифугирования с самоочищающейся камерой при рН, близком к 6,3, Концентрат содержит приблизительно 10 Ъ сухого вещества и около 40 Ъ интактных клеток.К 1 кг концентрата добавляют 38 мл коммерческого 50 Ъ-ного глутаральдегида при интенсивном перемешивании для тщательного смешения глутаральдегида с клеточным концентратом. После этого реакционную массу оставляют в покое при температуре окружающей среды,Спустя 1 ч реакционная смесь загустевает в однородную массу консистенции творога. Эту массу разбивают слабым перемшиванием и промывают двумя объемами деионизированной воды, после чего воду сливают.Эатем частицы геля переносят в вакуумную барабанную сушку, в которой приблизительно 1 кг продукта дегидратируют до веса около 160 г. В процессе дегидратирования мягкие геле- образные кусочки превращаются,в жесткие кусочки материала постоянных размеров. Дегидчатированные образцы измельчают далее до частиц с размером менее 1 мм в диаметре. Регенерация энзима от загрузки к загрузке будет изменяться от 50 до 60 Ъ его первонаальной активности. Однако около 15 вес.Ъ конечного продукта составляют чре",вычайно мелкие частицы материала (1 70 4). 2. Иммобилиэация замораживанием.Повторяют процедуру примера 1 до получения смеси концентрата клеток и глутаральдегида и получения гелеобразной массы неактивного препарата.После этого гель 1,в контейнере) помещают в глубокий холод и оставляют там в течение ночи. На следующий день замороженный гель оттаивают до температуры окружающей среды, при этом он превращается в водную массу. При перемешивании добавляют еще воды, после чего ее сливают. Эатем полученный продукт сушат в роторной сушилке до веса около 160 г.Конечный продукт состоит иэ пористых частиц, по внешнему виду несколько напоминающих хлопья. Восстановление первоначальной активности от загрузки к загрузке составляет 60-70 Ъ, фактически отсутствуют мелкие частицы. Размер частиц изменяется от 150 до 280010 . Препарат энзима предварительно вымачивают в 40 вес.Ъ глюкозного сиропа при комнатной температуре в течение 1 ч. Эту предварительно вымоченную изомеразу глюкозы загружают в различные колонки с водяной рубашкой. Поток глюкозного сиропа, обладающий определенной концентрацией, рН и другими характеристиками, приведенными в табл. 1, пропускают вверх через материал энэима. Скорость потока регулируют с целью получения степени конверсии выходя797582 10 щего сиропа 45. Линейная скорость всегда превышает 10 см/ч ,ограничение пленочной диффузии), Концентра,ция Са в этом. примере составляет .ученее 2,5 х 10 5 М,Продолжение табл. 1 55 65 40 7,6 0 8 х 10 б 65 40 7 б 3 5 х 10 8 х 10 Та блица 1 ве8 х 10 10 8 х 10 Используют колонки мера, т.е. колонки ра х 35 см и 5,8 х 45 см размер кавается диаме высоты колонны. Для к далее обозначают в ви колонн соответственно 5 гружают в 60 мл колон зима - в 1 л колонке. Все изомеризации про течение 450 ч. Затем и точную активность и про 20 ность на 100 161 С/г и и продолжительность конт 16 С/г. Результаты покразличного разэмером 1,5 хпри этом первый тра, а второй раткости колонны де 60 мл и 1 л9 г энзима ваке и 225 г эн 4 должаются меряют ост изводитель одсчитнваю кта на 100 заны в таб 60 40 х 10 3 65 40 4 65 40 3,5 х 10 8 х 10,5 б а Рабочие Кол акт нки Показатели по опытам 1 2 3оизводительность н0 16 С/г 42 34 5 41 Остаточная активностьЪ 65б Продолжительтакта на 100мнн ость кон16 С/г,0-140 90 Проиэводител100 16 С/гОстаточная а ость н 415 ивнос 9 6 9 Продолжительность контакта на 100 161 С/г,мин 0-13 В табл. 2 (и в подобных таблицах,оторые представлены ниже), где укаано несколько значений для продолжиельности контакта, первая величинаоответствует началу опыта с высоой активностью, а последняя - оконанию опыта с более низкой активносью,беэ Со , и п дуемого уров Приме сутствии и о Иэомериэа но в примере Следующие. параметры постоянными во время э Концентрация глюкоз рН на входе Добавление Со+1 Концентрация Са , М Ме Температура,оС Добавленье магния изменя 0 до Р х 10 М. После 450 ч изомеризации менты прерывают. Определяют ную активность и производит 100 161 С/г и подсчитываю тельность контакта .на 100 Результаты указаны в табри рН в пределахня.р 2. Иэомеризатсутствии .И 9 ф,ции проводят, ка1 комен я в приказа поддерживаюткспериментовг ы,вес. 40 следуюсть на ивностьем с до- ерживают 8,5 Нет 5 ее 2,5 х 10 655 тся от экспери- остаточльность продол С/г.3,овня р то1 С/г илучше снего,Со бунажи65лученные Иэ табл. 2 можно сделать щие выводы: производительно 100 161 С/г и остаточная акт являются лучшими без Со , ч бавлением Со+, если рн подд на рекомендуемом уровне, ес будет ниже рекомендуемого у производительность на 100 1 остаточная активность будут исполЬзованием Со , чем беэ но величины с использованием дут меньше, чем величины, по Ъ Г 4 5 6 75-145 75-180 75-270 75-18 155 75-125 75-170 75-170 75-179/ )82 12 Таблица 3 Колон- Рабочие характеристики П ка о Производительность на100 16 С/г 400 419 424 415 420 60 мл Остаточная. активность, ф 48 50 50 50 Продолжительность контакта на 100 10 С/г,мин 75-150 75-150 75-150 75-155 75-145 Производительность на100 10 С/г 410 435 435 450 440 Остаточная активность,1 л % 58 60 62 62 60 Продолжительность контакта на 100 10 С/г,мин 75-130 75-125 75-125 72-125 78-125 Из табл. 3Мд не влияет+Я.на 100 16 С/гность. Концентрация глюкозы,вес.% 40рН на входе 8,4Температура,оС 65.Переменный Мд"2, М 4 х 10Переменный Са, М Менее 2,5 х 10Активность в контрольной колонне (без Са ) измеряют с использованием параметров, показанных в скобках. После работы в течение 800 ч энзим в контрольной колонке теряет активность до 25 от своей начальной активности. Цифры в табл, 4 представляют собой Ъ активности по отношению к энзимной активности контрольной колонны после работы в течение такого же количества часов,видно, что добавление на производительность или остаточную активП р и м е р 3. Изомеризация с.изменяющимися отношениями Мд и СаИ.Изомеризации проводят согласно описанному в примере 1.Одновременно используют 5 колонн 35 по 60.мл, одну - с постоянным добавлением Мд+ к поступающему сиропу и без добавления Са , а другие - с изФ. +Я. меняющимися отношениями Мд и Са в глюкозном сиропе. 40Используют следующие параметры: Таблица 4 Часы Му/са. - . 1,4 Часы М/Оэ= 2,8 Часы МфСп= 4,2 Часы Му/бт= 8,4 1 10020 94 1 10020 96 1 100 1 100. 45 56 40 96 60 94 70 60 100 52 90 96 120 52 120 79 134 80 1 Ц 2 = -300 ч ЬХ/2 ==100 ч В/2 = .= 800 ч П р и м е р 4. Зависимость изомеризации от концентрации глюкозыв поступающем сиропе,Изомеризацию проводят, как описа 65 но в примере 1,Результаты па табл. 4 показывают, что отношением Мдф/Са является важным для срока службы энзима, отношение должно превышать 5, преимущественно 10,20 99 60 96 120 89 180 84 240 81 20 100 100 100 200 89 240 92 300 83 420 78 1(271000 ч797582 14 Таблица 5 Проиэводительностна 100 161 С/г С,а, иПродолжитеВ табл. бщ активности мпри рН 8,5 пр 380 статочная активость,% 50 5 85-17095-1 аблица рН 5,0 5,Активность, 5 15,0 6,5 7,О 8,5 9,0 9,5 5 60 7 5 100 95 Родолжение табл 7 40- 80 30- 60 25- 50 125 55 7 0 00 разме энэимаописаноисполь- обоэнаПеред агружают ют м, мСа, МПолучают следприведенные в та ующие и 408,065Нет0,0042,5 х 10при 600 450 Са", М Полу;ение препаре 1. Менееа Х (см. 150-110 Используют следующие параметры:Концентрация глюкозы,вес. 40-50рН на входе 8,4Температура,оС 65Со+ НетИ 9, М 0,004Сайф, М Менее 2,5 х 10.В табл. 5 производительность, остаточная активность и продолжительность контакта указаны для работы в течение 450 ч в 60 мл колоннах. Продолжнительностьконтакта, мин/1001 С С.75 П р и м е р б. Зависимость активности и стабильности от температуры, ЗЗИзомериэации проводят, как описано в примере 1, с использованием иэомераэы глюкозы,. полученной, как ойисано в примере 1. 7 колонн работают в изотермическом режиме при различных температурах в интервале 60-90 С. Измеряют начальную активность, а также полупериод (как время, необходимое для уменьшения активности на 50 от начальной активности).Используют следуКонцентрация глюрНТемпература+50 ющие параметры;козы,вес. 408,5ПеременнаяНетО, 014Менее 2,5 х 10ие результаты,7.Таблица 7 П р и м е р 5. Влияние рН на ак" тивность.Влияние рН на активность получаемой иммобилиэованной изомеразы глЮ- козы, полученной, как описано в примере 1, определяют в колонне с непрерывным потоком с заглушкой размером 2,5 х 35 см. Изомеризацию проводят, как описано в примере 1. Перед измерением активности колонну выдерживают в течение 5 ч для достижения равновесия. Затем величинарН загрузки изменяется до следующейвеличины, после чего колонна работает еще 5 ч. и т.д. При этом испольуют следующие параметра:Концентрация глюкозы,вес,Ъ 40рН Изменяется от5,0 до 9Температура,оС65Со Нет 0,00.Менее 2,5 х 10льность контакта,50показан относительныйаксимальная активностьинимается за 100 П р и ме р 7. Влияниечастиц на активность. За исключением полученияизомеризации проводят, какв примере 1, В этом примерезуют два препарата энзима,ченные Х и У соответственнотем, как препараты энэима з в колонны, их классиФициру При этом .используют следметры: Концентрация глюкозы,вес рН Температура оС Со+797582 15 продолжение табл 8 94 1000-1410 1410-2000 2000-2800 80 Таблица 9 50-35 9 4-500 50 39 07-10 34 от и. а 8,5еременнет ератур клемл взвеным ре- т олизированны абатывают 20 С 25 на 1 кг твием с 1,4 ес/объем 1. В рактически т Вторую часть авт ток концентрата обр 30-ного Огеи 11 ос Е си перед взаимодейс глутаральдегидом (в эультате получают и же самый продукт. Влияние размера ность препаратов Х табл. 8 и 9.вет абл 10 О л и ц на ак идно из ив 24 25 36 60 65 70 Таблица 8 3 б Прим т по 1 снп= 10плотность); вещества); клеток, см. Цв ьа а н- ОД, (оптич 05 в гмл измеренная 297-500 500-100 ое 9 Приготовление препарата У,Иммобилизация Флоккулянтом.1550 л культурального бульона отФерментации Вас. соадо 1 апь НРРВ 5656концентрируют путем центрифугированияпри 10 ОС, в результате чего получаютвзвесь, содержащую около 12 г сухоговеса, 100 мл концентрата.11 кг этого концентрата (рн 7,9)оставляют нри 20 ОС на 3 ч при осторожном перемешивании для того, чтобыосуществить автолиз. рН поддерживают 1 Она уровне 6,5 с помощью разбавленнойуксусной кислоты. К взвеси, содержа"щей более, чем 70 активных единиц,в растворимой Форме добавляют 330 мл50-ного глутаральдегидового раствора, в результате чего получают концентрацию глутаральдегида в реакционной смеси около 1,4 (вес/объем,Спустя 1 ч частично сшитый гель интенсивно перемешивают после добав Оления 20 л деиониэированной воды. К,этой суспензии добавляют 80 мл 30 ного раствора Вгеч 11 ос ЕС 25 для получения прозрачного раствора. Затемсуспензию отфильтровывают для того,чтобы удалить по мере возможности воду. Фильтровальную лепешку высушивают в вакууме .при 35 С. Высушенную леопешку измельчают до частиц размеромменее 30 мк. Активность определяютпо изомеризации в загрузке с высушенным распылением порошком, полученным из концентрата в качестве сравнения. Условия следующие: рН = 7,0,65 С, 0 1 С 5047 НрО/1 и 2 0И 9501. 7 НО/1, 40 глюкозы (вес/объем),З 5Питательную среду продувают азотом.Кажущаяся активность иммобилизованного фермента составляет более 70 посравнению с контролем. После использования иммобилизованный фермент уда Оляют Фильтрованием и повторно используют, Это повторяют 5 раз. После пятикратного повторного использованияактивность остается на прежнем уровне.45 Установлено, что стабильность н зависит в значительной степени от размера частиц. Как видно из вышеуказанных значений, активность нек торых препаратов больше зависит о размера частиц, чем от других пара метров.П р и м е р 8, Получение окрас Изомеризации проводят таким же образом, как в примере 1, б колонн полняют различным количеством энзим поддерживая степень конверсии и пр должительность контакта постоянным и равными 45 и 1 ч соответственноПри этом используют следующие и раметры:Концентрацияглюкозы, вес. 45рН 8 Х 10" БС а+, М Менее 2,5 х 10Наблюдается увеличение показателяа по соева, как показано в10, после л.100 ч изомериэаратура,оС Показател по 1 сОО 5 а2300 Энзим Изотермическая тператураоС Концентрация глюкозы, Ъ де 8,5 а 0,0008 0,0008 8 х 10Нет Нет Нет д Менее Менее2,5 х 10 2,5 х 10 енее ,5 х 1 Продолжительностьобщей изомеризации,0 450 роизводиельность100 161 С/г 4 Оста акти чная ость 0 Продолжительность контакта 100 161 С/мин 5-150 75-150 75-1 П р и м е р 9. Влияние размера колонны (по мере увеличения ее размера) .За исключение получения.энзима изомериэацию осуществляли так, как описано в примере 1.Энзим получают, согласно методике приготовления препарата У, описанной в примере 7, Размер частиц составляет 150-5002Используемые параметры указаны в табл. 11.Таблица 11Таким образом, ири увеличении размера колонны, начиная от 60 мл, способ иэомеризации можно осуществлять без каких-либо трудностей и при одинаковых показателях производительности и остаточной активности. Формула изобретения соб ио п. 1, о т л тем, что исходный глюкозу, в количес заств0 й содержит 45 вес.Ъ5. Сп щ и й с вляют п о т л и ч а юроцесс осуцест особ иоя тем, чри 60-70 осИсточникиые во внимаПатент СШАС 07 6 7/02,тотии). и ормации,при экспертиз88945, кл.лик. 29.01.74 ие 3 иупринят1. 1. Способ энзнматического превра"щения глюкозы во фруктозу путем пропускания раствора, содержащего глюкозу в количестве 30-55 вес.В и ионы.Мд , через колонку, со,;ержащую частицы иммобилизованной глюкозоизомераэы, при общем времени контакта от0 мин до 3,5 ч, температуре 60-850 С,рН раствора на входе в колонку 7,8-8,6, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью упрощения процесса и И улучшения качества юелевого поодукта,содержание ионов Мд+ в растворе составляет 10 -10 М, а раствор доиолнительно содержит ионы Са в количест+ве 10 -10 М, причем молярное со отношение концентраций Мд /Са составляет 5-500 при концентрации ионовМдл, большей 10 М, н 5-10 при кон-ьцентрации, меньшей или равной 10 М,а в качестве имлобилиэованной глюкоЗ 0 эоизомераэы используют нммобилизованную с помощью глутарового альдегидаглюкозоиэомераэу Вас. соад 01 аоз сразмером частиц 0,01-1 см, и процессведут непрерывно.35 2. Способ ио и. 1, о т л и ч а -ю щ и й с я тем, что концентрацияионов Мд составляет 10 В -5 х 10М, аконцентрация ионов Саф составляет10 8 -2,5 х 10 6 и ири соотношении концентраций Мдц/С,з (5-10):1.3. Способ ио и, 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что время контактаисходного раствора с иммобилиэованнойглюкоэоизомераэой составляет 10 мин2 ч.