Способ получения -галактозидазы

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК ПА 1 ЕНУУ Союз Советских Социалистических Республик,7 ееудеуетеевеы 9 кеаететСееете Мекеетрее ССВо аелеи заеретекккв еткриткй 8468(53) УДК 576,.8 (088.8 3) Опубликован 5,05,7 ллетень 1 45) Дата опубликования описания 2004 72) Авторы изобретен ИностранцыСигееси Нарита, Хиросуке НаганисАкиеси Йокуци, Ициро Кагая(Япония) Иностранная фирма Хоккайдо Шугар Ко ЛТД(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕН ГАЛАКТОЗИ 5 Изобретение относится к производству ферментов, в частности к технике получения о(. -галактозидаэы, используемой в качестве энэима для гидролиза рафиноэы в сахарозу и гал тоэу, и может быть использовано в свекловично-сахарной промышленности,Известен способ получения А -галактозидазы путем культивирования микроорганизмов рода АЬМВ 1 а на питательной среде 111 .Однако известный способ не обеспечивает достаточно высокого выхода: фермента. В ферментах, получаемых при культивировании микроорганизмов рода АЬе 1 до , присутствуют наряду с с(, -галактоэидаэой также и инвертаэа, Когда свекловичный сок или свекловичная масса (меласса) обрабатываются при использовании таких знзимов, то рафиноэа, содержащаяся в мелассе, разлагается под действием сс -галактозидаэы, тем самым снижается препятствие для кристаллизации сахарозы в ходе процесса производства сахара, которое создает рафиноза, и увеличивается выход сахарозы. Однако присутствующая в сочетании с б -галактоэидаэой инвертаза вызывает нежелательное раз"ложение сахарозы, 30 2В случае обработки большого объема мелассы количество разлагающейся под действием инвертаэы сахарозы увеличивается пропорционально, что приводитк снижению ее выхода.Целью изобретения является повышение выхода фермента, имеющего высокую активность А "галактоэидазы и не обладающего активностью инвертазы,Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе полученияо -галактозидазы путем культивирования микроорганизмов иэ рода АЬь 13 о на питательной среде, иэ микроорганизмов рода АЬь 1 д 1 а используют штамм А 1)ЬМ 1 а т 1 ьееба иаГао 1 эЫ ет, ет,. Найога АТСС 20430 или АЬЙйа р 1 ьеоВоНауопьй 1 е 6 Н 1 гапага чаю ре 6 и АТСС20%31.Оба штамма крайятся в Американской коллекции культур под номерами АТСС с 28 августа 1974 г.Питательная среда для культивирования микроорганизмов содержит источники углерода, например, крахмал, глюкозу, глицерин, мальтозу, декстрин, сахарозу и Инвертированную мелассу. Источниками азота служат, например, соевая мука, ореховая пудра, измельченные семена хлопка, кукурузная жид606554 19 20 Составитель А,Бражникова.Редакто О.Иванова Техред З,фанта. , Ко екто М.Демчик Заказ 2198/2 Тираж 568 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений иоткрытий 1 3035 Москва ЖРа ская наб. . 4 5филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4 пользуют штамм АЬь 161 а 1 ьео 1 а Масп 1 ь Ь 1 е Н 1 аЪа га АТСС 204 30 или АЬ ьЙ 1 арчьео 30 МРдап 1581 ет Н 1 га паго ча 1 гне МАТСС 20431. Источники информации,.принятые вовнимание при экспертизе: 1. Патент США 93832284,кл.195-11,1974.606554 гидроокиси натрия, после чего вводят0,3 карбоната кальция.Данную среду разделяют на 5 частейпо 200 мл кажцая и стерилиэуют. Настерилизованные порции срецы инокули руют суспенэии спор штаммов А Ь ь 1 д 1 аг г 1 ь е о Еа (АТСС 20430) и АЬ 51 с)1 аД г 1 ъ е о с а ча Р 1 Дпе Й (АТСС 20431)в количествах, каждое из которых дает2 х 10 спор.10 Затем микроорганизмы подвергаюткультивированию при встряхивании илиаэробному культивированию при темпеоратуре около 30 С в течение от 40 до70 час при регулировании РН в преде- (5 лах 5"8.В конце культивирования мицелийиспытывают на активность А -галактозидазы и на инвертазную активность.В качестве контрольной расы используют штамм А Ь бас) 1 а 5874,Результаты исследований приведейыв табл,1. Т а АЬЫйа дмеоРаАТСС 20430АЬь 1 йа д Р 1 ео 1 амаг 1 дпеИ 11ОТСС 20431АЬэ 161 а 1,453 х 10 04 1,30 188900 31100 1,816 х 10 04 1,29 58748,121 1,28 63100 45 Активность с -галактозидаэы определеот добавление 1 мл суспенэии ми- целкя к смеси 0,5 мл 0,06 М мелибиозы и 0,5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора с РН 5,2 и выдерживают 2 часа 50 при 40 фС, после чего реакционную смесь нагревают на кипящей водяной бане 5 мин для инактивирования энзима и добавляют 1 мл 1,8-ногоВО(оя) 8 ндО и 1 мп 2"ного семигидрата сульфата цин ка для удаления протеина. Полученную смесь центрифугируют а поверхностный слой, свободный от протеинов, анализируют на содержание глюкозы глюкостатным методом.60Учитывая, что количество глюкозы, Освобожденной от мелибиозы, и концентрация энэима находятся в пропорциональной взаимосвязи, соответствующей цо 1000 микрограмм глюкозы, суспензию заранее разбавляют так, что она пс 65 кость, мясной экстракт, пептон, дрожжевой экстракт, нитраты и соли аммония. Используемые неорганические соли включают, например, хлористый натрий, хлористый кальций, сульфат магния, сульфат марганца, сульфат железа, фосфаты и карбонат кальция. При необходимости в среду вводят витамины.В качестве индукторов для эффективного продуцирования ь, -галактозидазы в миделии используются такие вещества как лактоза, рафиноза, мелибиоза и галактоза. Способ осуществляют следующим образом. Питательную среду готовят следующего состава (%): лактоэа - 1,5, глюкоза - 0,5, сульфат аммония - О,б, кУкУРУзная вытяжка - 1,0, КНР 04- 0,4, М 50 7 Н О - 0,2, хлористый йатрий 0,2, РН доводят до 5,5 добавлением падает в пределы измерения, удовлетворяющие этой взаимосвязи. Количество свободной глюкозы умножают на число разбавлений, Активность с(, -галактозидазы, которая освобожцает 1 микро- грамм глюкозы, принимается за единицу.Активность инвертазы определяют добавлением 1 мл суспензии мицелия к смеси 0,5 мл 0,06 Я сахарозы и 0,5 мл 0,1 М Фосфатного буферного раствора при РН 6,0 при тех же условиях реакции, как и для с -галактозидазы. Далее реакцнонный раствор центрифугируют, удаляют протеины, а поверхностный слой анализируют на содержание инвертного сахара по методу Сомогии-Нельсона. Активность инвертазы, которая дает 1 микрограмм инвертного сахара, принимают за единицу.Вес сухого мицелия определяют сушкой при 105 С того количества его,,99 х 10 57 О,которое выращивают в 100 мл культу- ральной среды с последующим взвешиванием.Данные табл.1 показывают, что активность 4 -галактозидазы, полученной по предлагаемому способу, выше, 5 чем при использовании известйого способа (контроль), при этом полностью отсутствует активность инвертазы.При культивировании штаююов по пред лагаемому способу к среде добавляют ф органическую кислоту, например гликолевую, лимонную, молочнУю, яблочную, фумаровую, виннокаменную, янтарную, глутаровую, малоноаую, малеиновую, пировиноградную или галактуроновую, )я в качестве вещества для промотирования роста е(. -галактоэидазы, в количестве, составляющем 0,2-1,0 в расчете на среду. Получаемый мицелий хранят в форме таблеток, которые упаковывают или добавляют в реакционные емкости и сосуды. Мелассу пропускают через реакци онную емкость при рН 4-6 и 30-60 С.Во время контактирования мелассы с мицелием рафиноза, присутствующая в мелассе, гидролизуется в сахарову и галактозу, Благодаря тому, что в эн зимах не содержится инвертаза, энзиматический гидролиз происходит только на рафиноэе и не протекает на саха-.розе.П р и м е р 1. Среду следующего сос 86 тава, (%): лактоза - 0,5, глюкоза 0,7, сульфат аммония - О, 1, КН Р 04 - 0,4, М 50, 7 Н О - 0,2,(ИН ) СО - 0,06, хлористйй натрий - 0,2, кукурузная жидкость - 1,2 доводят до РН 5,5 гидРа том окиси аммония. В ферментер емкостью 20 л помещают 15 л среды и 800 частей на 1 млн.ко-, .колина, добавленного в качестве пеногасящего агента, и стерилизуют 30 мин под давлением 1,2 кг/кв.см. Среду затем охлаждают и в нее инокулируют сус пензию спор, полученную культивирова- нием АЪ 6141 а дг 1 ее оеа о 1 а"пе п 11 (АТСС 20431) в картофельно-глЮкозиой агаровой среде при 27,5 фС в течение 10 дней, в количестве, дающем 1 х 10 спор/куб.см среды. Культивирование осуществляют при 30 фС 18 час при аэрации со скоростью 1/4 объем/объем/ /мин и при перемешивании со скоростью 250 об/мин.Полученный мицелий используют в качестве посевного материала.Среду следующего состава (В): лактоза - 1,5, сульфат аммония - 0,6, кукурузная жидкость - 1 О, ХН 2 РО -0,4, семигидрат сульфата магния - 0,3, хлористый натрнй - 0,2, доводят до РН 5,5 ,и 15 л среды помещают в ферментер объемом .20.л и с 1280 частей на 1 млн. коколина, добавлвнного в качестве пеоогасящего агента, и,стерилизуют 30:мин под давленйем 1,2 кг/кв.см. На данной среде инокулируют 500 мл указанного посевного материала и культивируют при 30 вС при аэрации со скоростью 1/4 объем/объем/мин и при перемешиваиии со скорс,тью 350 об/дайн. Культивирование прекращают при достижении содержания сахара в среде 0,1 Ъ (по количеству глюкозы по методу Сомогии) культивирование в течение 44 час.Отношение между временем культивирования и количеством й.-галактозидазы приведено в табл.2Анализ культурального бульона обнаруживает полное отсутствие инвертазы.606554 ыежду временед культивирования и коли"чеством образовавшейся О -галактозидазы приведена в табл,З,анализ культ альногоу ур льного бульонапоказывает полное отсутствие инвертаэы.аТаблица 3 ухой миелий,г/10 Омл ч е с б,0 5800 8 120,7 3 162900 5,8630 4,1,497 х 10 П р и м е р 3. К каждой из двенадцати порций основной среды состава 1 В)глюкоза - 0,5, сульФат аммония - О,б, Ъкукурузная жидкость - 1,0,(НРО-О,4,МЪО,7 НяО - 0,2, хлористый натрий0,2, СОСО,3, добавляют сахар иэдвенадцатй различных сахаров табл,4в количестве, соответствующем 1,5.Среду готовят вначале растворениемкомпонентов в указанном составе, ис-ключая Са,СОдоведением смеси дорН 5,5 и последующим введением карбоната кальция. 45Порции ср:объему распр еды по 200 мл каждая по еделяют в колбы Сака уч таточный хар в виглюкозы, г/ 100 мд О 3 илоза 2043 0 043 О 43,О ,О О 2 0430 0 коз 8 О О П р и м е р 2. АЬъд 1 озаа 3 с; АТСС 20430 культивируют в среде и ус- ловиях, как в примере 1. Зависимость объемом 1 л и стерилизуют 30 мин под давлением 1,2 кг/кв.см, Затем инокулируют суспензии спор АЬМЙ 1 о Д 1 вео 3 а отсс 204 и АЪ зд 1 а р 1 зеаИа чо П е ЬАТСС 20431 в количествах, дающих 1 х 10 спор/куб.см среды: 1;ультивируют при ЗООС 60 час на возвратно-поступательном вибраторе при амплитуде 7 см со скоростью 136 об/мин.1 езультаты приведены в табл,4. Анализ показывает полное отсутствие иннертазы во всех ыцелиях, на которых нсьольэуютая 12 разлнчных сахаров.Т а блица 4606554 аха таточ ный хар в виглюкозы, /100 мл 0430 1,21 0 1,23 0 уктоз 20 0430(ОТСС 20430) иг (цюеЙйтвах, дающихи далее кульение 60 час нам вибраторе6 об/мин. изаЫьтивируют таву вышебавки лие культие условиях вность с(,.5. Из табл.4 видно, что индуцирующиевещества, которые ранее использовалидля получения д. -галактозидазы прикультивировании известных штаммов,эффективны и в культуре микроорганмов по предлагаемому изобретению,эффект лактозы является наиболее всоким,П р и м е р 4. Основную среду состава (Ъ: лактоза - 1,5, глюкоза - Осульфат аммония - 0,6, кукурузная жикость - 1,0,КН Р 0-0,4, семигидрат мания - 0,2, хлористый натрий - 0,2,смешивают с 0,6 лимонной кислоты,взятой в качестве вещества, промотирующего образование А -галактозддазызатем РН доводят до 5,0 гидратом окиси аммония и к смеси добавляют 0,2карбоната кальция. Порции среды по200 мл каждая распределяют в колбы Продолжение таблицы 4 Сакагучи объемом 1 л и 40 30 мин под давлением 1 На среде инокулируют с А Ьь 1 йзо дг зе оба Абз(д 1 а Рг 1 зеоГо чаДля срав штаммы кулв. среде, иден ой по сосуказанной среде, но без домонной кислоты. Контрольновирование проводят в тех жбульоны анализируют на акти66 -галактозидазы.Данные исследований приведены(АТСС 20430)ддобавля- ется Аазй 1 о р Ыеи шта 16 а 5 К.каздреди примерличных оргв табл, 6 и иэ 11 пора 4 добавлаот иических киси 7 в колиПримеций основнойодну иэ 11 ралот, укаэанных 214 х 10 08 ликолевая 47590 3, 730 х 103,487 х 10Ф3,150 х 10 1,276 1,175 1,208 1,394 олочная блочнаяОс 150,190 ,203 ,246 310 0 267300 2,145 х 10ф 1,237 227 1,841 х 10 1,758 х 104 1,758 х 10 1 564 х 10 О 31000 0 1,294 1,228 1,260 лутароваяалоновая 215900 197100 08 07 0 алеиноваяировинорадная 260 226200 1,795 х 10 0 0,05 2,237 х 10 2736 200 1,384 х 10 1,280 02 35лоты в раэличветствувкцих ОПри тех же услча 1 дюе Ъ40 Я"1 зффц ТСтивированию.РеэультатЫственно прявед 7 показывают, чтослоты обладают эФ"отировании ростатак же, как лиДанные таблб и все органические ки фективностью в пром с(, -галактозидазы монная кислота. Примерб. К примера 4 доб ную, молочную(АТСС 20431) и АЬ 5141 аС 20430) подвергают куль орции ос ляют нез гликолев внойисимокиссреды лимон б а 346100 2,758 х 1 0,2 0,4 02 1 монна я,б Об 1 769 х 10 0463 бх 10 0 78700 62900 8 1,27 0,09 1,273 ЯблочнаяФумароваяВиннаяЯнтарная Галактуроновая Контроль (без добавки органической кислоты) с ледований соответ в табл. 8 и 9.606554 18 личенное содержание сахарозы. Болееточно образец проявляется в растворителе, состоящем из 6 частей н-бутанола, 4 частей пиридина и 3 частейводы. Зоны рафинозы и сахароэы отде ляют, промывают водой и анализируютс помощью цистеин-карбазольного процесса.Установлено, что 81 первоначального содержания рафинозы разлагается, 10 а содержание сахарозь) увеличиваетсяна 3 19 г.П р и м е р 8, 200 г свекловичноймелассы 30 (по Бриксу), приготовленной как в примере 7, с мицелием, имеющим активность О -галактоэидазы17640000, единиц, дают возможностьреагировать так же, как в примере 7.После реакции мицелий промывают водой,добавляют к новой порции разбавленноймелассы и выдерживают для реакции,Таким образом мицелий используют. понторно семь раз, полученные растворыанализируют на остаточное содержаниерафинозы и на увеличение содержаниясахароэы.Данные исследонаний приведены втабл.10.Т а б л и ц а 10, 48Данные табл.10 показывают, что активность А. -галактозидазы, содержащейся в мицелии плесени, по предлагаемо" му изобретению снижается только на 16 даже после ее семиразового использования для обработки свекловичной мелассы, и сС -галактозидаэу после такой обработки можно использовать для разложения рафинозы.П р и м е р 9; Свекловичную мелассу разбавляют до 50 (по Бриксу) и рН 65 доводят до 5,2 добавлением серной кислоты, 200 г данного раствора, содержащего 9,8 г рафинозы, мицелий плесени(имеющий сухой нес 1,619 г и активность с- -галактоэидазы 29400000 единиц), полученный в примере 1, дают возможность реагировать при 50 .С во течение 2 час 30 мин. В конце реакцИи раствор анализируют на степень разложения рафинозы и на увеличение содержания сахарозы. длагаемытозидазениемовышениысокуюи новых1 о, аАТСС 2г "пеЬ Пре-галакным решвает пщего взованиАЬ з 1 доЕаорла ча Из данных таблиц 8 и 9 видно, что количество любой из органических кислот, добавленных для промотирования продуцирования А -галактозидазы, находится в пределах от 0,2 до 1,0 и что количество А -галактозидазы постепенно уменьшается по мере увеличения органической кислоты за пределами 1,0. П р и м е р 7. Свекловичную мелассу разбавляют водой до 30 (по Бриксу) и рН доводят до 5,2 добавлением серной кислоты. 200 г полученного раствора, содержащего 5,8 г рафинозы, мицелия микроорганизма по данному изо - бретению, имеющего сухой вес 0,971 г и 17540000 единиц д. -галактозидазы, согласно примеру 1, подвергают реак-ции при 50 С в течение 2 час 30 мин при встряхивании. Затем мицелий отделяют фильтрованием и промывают водой, фильтрат и .промывные воды объединяют и определенный объем данной смеси анализируют с помощью бумажной хроматографии на остаточное содержание рафинозы и на увеПри этом устанавливают, что раэлагается 60,4 рафинозы, а приростсахароэы составляет 3,99 г. й способ получения О(, ы по сравнению с иэвесттой же задачи обеспечие ныхода фермента, имею- активность, при испольмикроорганизмов из рода именно А Ь з 1 а 1 а д г ( е и АЬэ(д 1 аг 1 ье АТСС 20431. Формула изобретенияСпособ получения А -галактозидазы путем культивирования микроорганизмон рода А Ь э 1 д 1 а на питательной среде, отличающий с я тем, что, с целью повышения выхода фермента, из микроорганизмов рода й Ь ь 14 1 О ис