Способ определения метгемоглобинредуктазной активности эритроцитов

) 4 0 01 М 33 33/4 САНИЕ ИЗОБРЕТ ИДЕТЕЛЬСТВ РСНОМ 3758663/28-1418.05.84 азССРательскиогииБиржаазахскии научно-иссл нкологии и радио Токтамысова, Н.ХБалмуханов 15(088.8) институт (72) 3 С нова и (53) 6 (56) К формы Медици,С, Клингемоглоб 159. ие овскииеждени1968,на ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТГЕМОГЛОБИНРЕДУКТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ(57) Изобретение относится к биохимиии клинической гематологии, предназначено для определения метгемоглобинредуктазной активности эритроцитов.Цель, изобретения - повьппение точностии ускорение способа за счет сокращения числа стадий. Для этого эритроциты гепаринизированной крови отделяютот плазмы центрифугированием, триждыотмывают в буфере рН 7,4, содержащем0,01 М КН РО К НР 04 и 0,8 Ж ИаС 1.К осажденным эрйтроцитам добавляютравный объем 0,57-ного нитрата натрия на физиологическом растворе, смесь инкубируют 10 мин, за это время окисляется 85-957 гемоглобина. Затем эритроциты 5-кратно отмывают в фосфатном буфере. Две пробирки с равными объемами нитритных эритроцитов инкубируют 3 ч при 37 С. В одной пробирке 10 мМ глюкозы и 2 1 О М метиленового синего, в другой добавки отсутствуют. В термостатирующую ячейку, содержащую 1 мл пробы, при перемешивании 37 С вносят 10 4 М К Ре(СБ)з б и регистрируют изменение окислитель- но-восстановительного потенциала суспензии с помощью платинового электрода ЭПВ, хлорсеребряного электро-да ЭВЛМЗ на рН-метре рН, с выхода которого сигнал подается на самописец КСП. Скорость восстанов- фав ления феррицианида калия определяют ф по времени восстановления стандартного количества КЗРе(СИ)б и выражают в ммоль Ре/л эритроцитов/ч.,Значения этой скорости, характеризующие метгемоглобинредуктазную активность, возрастают во времени в пробе с глюкозой и метиленовым синим и не изменяются в пробе без добавок (контроль), 1 табл.1 130219Изобретение относится к биохимиии клинической гематологии и можетбыть использовано для определенияметгемоглобинредуктазной активностиэритроцитов.5Цель изобретения - повышение точности и ускорение способа за счет сокращения числа стадий.Способ осуществляют следующим образом.Эритроциты гепаринизированной крови отделяют от плазмы центрифугированием, трижды отмывают в буферерН 7,4, содержащем 0,01 М КН РО //КНРО и 0,8% ИаС 1. К осажденнымэритроцитам добавляют равный объем0,57-ного нитрита натрия, приготовленного на физиологическом растворе,и смесь инкубируют при комнатнойтемпературе в течение 10 мин, За этовремя окисляется 85-95% гемоглобина.После инкубации эритроцита 5-кратноотмывают от нитрита в Фосфатном буфере. Готовят 3-47-ную суспензию 25эритроцитов в Кребс-Рингер Фосфатномбуфере (120 мМ ИаС 1, 4,8 мМ КС 1,1,3 мМ СаС 1 , 1,2 мМ БдЯО , 16,5 мМЪБаН РО /Ма ЙРО , рН 7,4), Две про 2бирки с равными объемами нитритныхэритроцитов помещают в качалку и инкубируют 3 ч при 37 С, причем в одной пробирке присутствует 10 мМ глюкозы и 2 1 О М метиленового синего,а в другой пробирке добавки отсутствуют. В термостатируемую ячейку, со 35держащую 1 мл пробы при 37 оС при перемешивании вносят 10 М К Ре(СИ) ийрегистрируют изменение окислительновосстановительного потенциала суспензии с помощью платинового электродаи хлорсеребряного электрода на рНметре, с выхода которого сигнал подается на самописец, Скорость восстановления феррицианида калин определяют по времени, необходимому длявосстановления стандартного количества К Ре(СИ) , и выражают в мМ Ге/лэритроцитов/ч. Значения этой скорости, характеризующие метгемоглобинредуктазную активность, возрастают вовремени в пробе с глюкозой и метиленовым синим и не изменяются в пробебез добавок (контроль)П р и м е р. Используют суспен 55зию эритроцитов, содержащую 6,03"10 М гемоглобина.5Относительные изменения скоростивосстановления Феррицианида калияво времени предсталел в таб -лице,Время Т (сравнение заравные промежутки времени при инкубации) Относительные изменения скорости восстановления Феррицианида калия,7 Т -Т /Т -Т2 о о о оТ -Т /Т -Тзо до до оТ -Т /Т -То зо зо иТ -Т /Т -Т9 4 о до зоТ -Т /Т -Т55 50 50 15-Т /Т -Тбо 55 Ы 5 о 70 72 67 83 38 бб Формулаизобретения Способ определения метгемоглобинредуктазной активности эритроцитов путем обработки эритроцитов нитритом натрия, инкубации с субстратами и кофакторами с последующим определением активности по скорости восстановления метгемоглобина, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения точности и ускорения способа за счет сокращения числа стадий, после инкубацни к суспензии цельных эритроцитов добавляют феррицианид калия, а скорость восстановления метгемоглобина определяют по скорости восстановления феррицианида, регистрируемой потенциометрическй. Проводят касательную к начальному участку кривой зависимости скорости от времени и определяют,что за 10 мин изменения скорости восстановления Феррицианида калия 3,1 мМ Ре/л эритроцитов/ч, а изменения скорости восстановления феррицианида калия,отнесенные ко времени 1 мин, 0,31 мМ Ре/л эритроцитов/ч. Проводя дальнейшие преобразования, получают,что скорость восстановления феррицианида калия равна 5,17 мМ Ре/мин, что в пересчете на 1 гем составляет 1,30 мМ Ре/мин - метгемоглобинредуктазная активность эритроцитов в данной пробе,