Способ выделения ингибитора ангиотензин-1-превращающего фермента из яда животного происхождения

(5)5 С 07 К 3/12, 7/10 ОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К оснина, 3. Голубенко и А. А. Аху 0 ои О РСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Институт биоорганической химии АНУЗССР(56) ГЛ 1 дие 1 АОпдеп Г 1, 1 Еп 111 у Р, Я.Апдо 1 епз 1 п-сопчегтпд Епдуте 1 пЫЬ 11 огз1 гопз йе чепоа о 1 Восгорз 1 агагаса.зоакоп,Еоссакоп оГ Ясгцсмге ап( Яупйезз, -Восйегпвагу, 1977, ч. 19, М 22, р. 300.(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИНГИБИТОРААН ГИОТЕ Н 3 ИН-П РЕ В РАЩАЮ ЩЕГОФЕРМЕНТА ИЗ ЯДА ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ(57) Использование: биохимия, получениебиологически активных веществ. Сущностьизобретения: способ получения белка-ингибитора ангиотензин-превращающегофермента заключается в выделении цельного яда из экстракта гомогената ядовитой Изобретение относится к биохимии, в частности к способам получения биологически активного белка, который может быть использован в медицине как потенциально- терапевтическое средство антигепертензивной направленности.Известны пептиды с лнгибирующей ак- тивностью к АПФ, выделенные из яда змеи Войгорз )агагаса;Способ выделения представлен на схеме (фиг. 1). Как видно из схемы, выделение пептидов из яда змеи Войгорз)агагаса прожелезы паукаатгосесмз 1 гебес 1 вдц 11 а(из, фракционировании его на гидрофильном геле поперечносшитого декстрана для отделения низкомолекулярной фракции с мол, массой 5 - 10 кДа, дальнейшем разделении полученной фракции на ДЕАЕ-сефадексе при рН 8 в линейном градиенте концентрации йа С 1, последующей очистке ее на колонке с гелем Ультропак Спри умеренном давлении в 0,5.%-ном ацетонитрилфторацетатном буфере с рН 6,5, определении ингибирующей активности в полученных фракциях, отборе активной фракции и ее сушке. Получают белок-ингибитор, содержащий 94 аминокислотных остатка смол массой 10 кДа, изоэлектрической точкой Р 4,7 с М-концевым остатком - глчтаминово кислотой и СБо, равной 1 х 10 М, и константой ингибирования Кь равной 5 х 10" М. Высокая активность белка создает предпосылки для использования его в качестве терапевтического средства антигипертензивной направленности. 11 ил,тся поэтапно путем гель-фильтрации ного яда на сефадексе 6-25 (элюант - 0,2 М уксусная кислота), полученную активную фракцию подвергают ионообменной хроматографии на СМ-целлюлозе ОИ,. причем элюцию проводят ступенчато от 0,005 до 0,.2 М аммонийацетатным буфером, после получения двух фракций, первую, обладающую ингибирующей активностью, делят на ионообменнике - ДЕАЕ-сефадексе, элюируя аммонийбикарбонатным буфером при линейном градиенте от 0,005 до 1 М, 1730088затем отбирают одну из полученных 10 фракций, обладающую ярко выраженной ингибирующей АПФ-активностью, и подвергают ее гель-фильтрации на сефадексе 6-25 в этилацетатном буфере; для выделения наиболее активного и гомогенного пептида используют электрофорез на бумаге,Полученный пептид-ингибитор характеризуется 1 С 5 о, равным 0,3 мкг/мл,Как видно из приведенной схемы (фиг. 1), способ выделения этого пептида трудоемок, необходимо приготовление разнообразных буферных растворов, при этом полученный пептид обладает низкой активностью,Цель изобретения - повышение ингибирующей активности,Цель достигается получением белка-ингибитора фермента АПФ, содержащего 94 аминокислотных остатка, с мол, массой 10 кДа, изоэлектрической точкой Р; 4,7 с й-концевым остатком - глутаминовой кислотой путем выделения цельного яда из экстракта гомогената ядовитой железы паукаасгобессцз тгебес 1 в 9 ццатцэ фракционированием его на гидрофильном геле ТИК - НИ/- 55 для отделения низкомолекулярной фракции с Мг 5-10 кДа, дальнейшего разделения полученной фракции на ТИК-ДЕАЕ при рН 8 в линейном градиенте концентрации ИаС 1, последующей очистки ее на колонке 01 тгорас 6-2000 при умеренном давлении в 0,5%-ном ацетонитрилфторацетатном буфере с рН 6,5(схема на фиг, 2), определения ингибирующей активности в полученных фракциях и отбора активной фракции.Сопоставительный анализ полученного белка-ингибитора АПФ с известными позволяет сделать вывод, что белок,. выделенный из яда паука 1, сгебес 1 тццттасцэ обладает высокой константой ингибирования, а также отличается приемами и режимами выделения его из яда,На фиг. 3 показана хроматограмма разделения яда паукаатгобессцз тгебесип 9 цпатцз на ТИК-НЧЧ; на фиг. 4 - хроматограмма разделения активной фракции на ТЗК-ДЕАЕ; на фиг, 5 - хроматограмма на колонке Отгорас 6-2000 при умеренном давлении в 0,5 -ном ацетонитрилфторацетатном буфере, рН 6,5.П р и м е р 1. а) Приготовление природного сырья.Цельный яд получают от взрослых самок пауков (5000 особей) и репарацией хелицер и последующей их гомогенизацией при 0-4 С. Гомогенат центрифугируют при 20000 об/мин в течение 30 мин, супернатант отделяют и лиофилизируют. Лиофильоно высушенный яд хранят при 0 С,б) Выделение активной фракции,500 мг сухого яда растворяют в 5 млтрис-НС-буфере, рН 8,0, 0,05 М наносят наколонку с гидрофильным гелем ТИК-НИ/-55.Сорбцию проводят в 0,05 М трис-НС-буфе 5 ре, рН 8,0, элюируя тем же буфером. Получено 6 фракций. Детекцию проводят придлине волны 280 нм (фиг. 3), Каждую изшести фракций исследовали на ингибиторную активность. Из фиг, 3 видно. что получе 10 но 6 фракций.Фракции 1 и 1 представляют собой высокомолекулярные белки, фракции 11 и Иполипептиды с мол. массой 5 - 10 кДа,фракция 111 проявляла высокую ингибитор 15 ную активность, фракции Ч и Ч 1 - веществанепептидной природы.Фракцию 11 собирают и лиофильно высушивают. Выход 150 мг,Фракцию 111 подвергают дополнитель 20 ной очистке: для этого 150 мг фракции 111растворяют в 2 мл трис-НС 1-буфера, 0,05 М,рН 8,0, и наносят на колонку с ТИК-ДЕАЕ,уравновешенной 0,05 М трис-НС 1-буфером,рН 8,0, в градиенте концентрации МаС 125 0,05 - 0,2 М. Скорость элюции 33 мл/ч(фиг, 4). Из фиг. 4 видно, что фракция 111делится в этих условиях еще на 3 фракции,Отбирают только фракцию 111-2, проявляющую высокую ингибиторную активность.Выход 90 мг. Затем фракцию 111-2 наносят30 на колонку (7,5 х 600 мм) 01 тгорас 6-2000 ипроводят разделение при умеренном давлении, используя в качестве элюанта 0,50 - ный ацетонитрилфторацетатный буфер, рН6,5(фиг,5). Гомогенность полученного белка35 иллюстрируется фиг,5, где показано, что этафракция элюируется с колонки в виде одного симметричного пика, Выход 40 мг,Полученный ингибитор АПФ после высушивания представляет собой белое40 хлопьевидное вещество, хорошо растворимое в воде.. в) Доказательство гомогенности инибитора АПФГомогенность ингибитора, выделенного45 из яда паука .атгобестцз тгебес 1 е 9 ццамэ,доказана электрофорезом в градиенте ПААГ10 - 24 с 0,1 ИДЯ, Мол. масса, определенная этим методом, составляет 10 кДа. Изоэлектрическая точка находится в кислой50 области (Р 4,7). Аминокислотный составбелка установлен по результатам 24-, 48-,72-часовых гидролизатов; Ингибитор состоит из 94 аминокислотных остатков с и реимущественным содержанием гистидина,55 глутаминовой кислоты, глицина, На й-концеобнаружена глутаминовая кислота, Наличиев структуре сульфидных связей обеспечивает стабильность ингибитора к нагреванию вкислой среде,45 твором флурескомина в ацетоне, 50Полученные данные (фиг, 7) показывают, что полипептид, выделенный из яда паукаатгобестцз ангесесипдцттатцз. ингибируетАПФ, так как в брадикинине не расщепляется связь Про - Фен, которая специфична7 8для АПФ, Это также свидетельствует о том, что полипептид, выделенный из яда паука, полностью ингибирует активность АПФ,г) Определение ингибиторной активности проводят двумя методами.Флуориметрический метод,Для этого 0,1 мкг АПФ предварительно инкубируют в 1,9 мл 0,005 М мединалового буфера, рН 7,4, с белком из яда паука в течение 20 мин при 37 С, а затем добавляют 0,1 мл 1 мМ раствора-субстрата (кбз-фенгис-лей) с последующей флюорометрией, Для этого к пробам (стандартным и исследуемым) добавляют по 0,4 мл 2 М раствора КаОН и 0,1 мл 1 ОД-ного раствора о-фталевого диальдегида, Через 6 мин после добавления диальдегида к пробам приливают по 0,2 мл 6 н, раствора НС, Интенсивность флюоресценции замеряют на флюорометре фирмы "Ортоп",Ингибирующее действие анализируемого белка на АПФ оценивают по снижениюактивности фермента соответствующей концентрации ингибитора, Полученные величины наносят на графики и вычисляют величину Со, которая равна 1 х 10 М, Константа ингибирования К=5 х 10 М (фиг,6)-8Методом тонкослойной хроматографии на силикагеле препарат фермента (1,5. Е) предынкубируют при 37"С в 0,1 мл 0,02 М ча-фосфатного буфера, рН 8 содержащего 30 мкг ингиЬитора из яда, в течение 30 мин, Затем прибавляют 0,1 мл раствора БК (30 мкг) в том же буфере и продолжают инкубацию еще 20 мин, Реакцию прекоащают подкислением до рН 2 (0,01 мл 1 н. НС), В качестве "свидетеля" ферментативный гидролизат брадикинина получают следующим образом: БК(30 мкг) инкубируют 20 мин при 37 С с АПФ (1,5 мЕ) в 0,2 мл 0,02 М Ка-фосфатного буфера, рН 8, Реакцию останавливают 0,01 мл 1 н, НС до рН 2. Аликвоты гидролизатов наносят на пластинки 10 х 10 см с тонким слоем силикагеля Кез 9 е - 60 ("Мегок") параллельно с контрольными приборами и пептидами-"свиде-.телями", Хроматографию ферментативныхгидролизатов проводят в системе растворителей н-бутанол-вода-пиридин-уксусная кислота (15:12:10:3), Положение пятен нахроматограммах выявляют в УФ-свете после опрыскивания пластин 0,02 о-ным рас 5 10 15 20 25 30 35 40 Исследование выделенного белка показывает, что он является новым соединением, проявляющим на порядок выше ингибиторную активность, чем пептид, выделенный из яда змеи.П р и и е р 2. Аналогичен примеру 1 б, за исключением того, что для фракционирования цельного яда используют колонку с гел ь-сефадексом 6-50 (фиг, 8).П р и м е р 3, Аналогичен примеру 1 б, за исключением того, что фракционирование ведут 0,05 М в трис;НС-буфере, рН 7 (фиг, 9),П р и м е р 4, Аналогичен примеру 1 б, за исключением того, что фракционирование ведут при рН 6,5 (фиг. 10).П р и м е р 5, Аналогичен примеру 1 б, за исключением того, что фракционирование ведут при рН 8,5 (фиг. 11),Как видно из фиг. 8, разделение низко- молекулярных фракций на гель-сефадексе .6-50 происходит недостаточно эффективно.Из фиг, 5-9 видно, что наиболее оптимальное разделение достигается при рН 7- 8,Таким образом, изобретение дает возможность получить высокоактивный и устойчивый белок-ингибитор АПФ, который, может быть использован в качестве средства для регуляции активности ренин-ангиотензивнсй, а также калликреин-кининовой системы 8 организме.Формула изобретенияСпособ выделения ингибитора ангиотензин-превращающего фермента из яда животного происхождения, предусматривающий фракционирование его на хроматографических колонках, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения ингибирующей активности, используют яд паукаатгобестцз тгегес тццпатцз, фракционирование проводят на колонке с поперечносшитым декстраном с размером частиц 30-60 а м и разрешающей способностью по белку 1000-600000 в 0,05 трис-НС буфере, рН 8, отбирают активную фракцию и хроматографируют ее на колонке с диэтиламиноэтилсефадексом с размером частиц 44 - 88 рс м, уравновешенной 0,05 М трис-Н С буфером, рН 8 в градиенте концентрации МаС 0,05-0.2 М, затем подвергают гель- фильтрации на колонке с гелем Ультропак 6-2000 с размером частиц 102 р м и разрешающей способностью по белку 500-6000 Г и активную фракцию высушивают,бумажная ромтаерафоя Х сна я а т 1Ий О ЛЛ еюая мраиоптуаЯ-стйдаю пщгрцФцю нп амик Фгс рас 6-2000 Л 4