Способ получения бычьего гормона роста

СОЮЗ СОВЕТСКИХшвмлатьнеаежРЕСПУЬЛИК ИЕ (В/00 12 юл, У 16мпани Щ)ский Криви77.2(048)(0Аса, Бс е,8)ЦБА,(54) СПОСОБ ПОЛУНА РОСТА(57) Изобртической и ЕНИЯ БЫцЬЕГО ГОРМО етение относится нженерии и касае гене я полуИзобретениеской инженер к генети относ инантн рекомбта.Не повышение био бычьего гор ия из обрекой акт вностиношенив. логич стим ля оста в оции у кор мон лак ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТЮ ИИВЮЗЮЮ и ОФюииыПРИ П 1 НТ СССР(56) Ргос. Мае)р. 5403-5407,и и касается получения бычьего гормона рос Бычий гормон роста получают пу- . тем конструирования рекомбинантной плазмидной НК, кодирующей бычий гормон роста, в результате выделения кПНК иэ плаэмиды рГН-1, встраивания кодона для аланина вслед за АТГ кодоном, реклонирования в плазмиду р Ъ СН -1, трансформации полученными рекомбинантными ЛНК штаммов Е.со 1 д с последующим выделением и очисткой конечного продукта. чения рекомбинантного бычьего гормона роста. Цель изобретения - повышение биологической активности бычьего гормона роста в отношении стимуляции лактации у коров. Бычий гормон роста получают путем конструирования р комбинантной плазмидной ДНК, кодиру ющей бычий гормон роста в результате выделения ДНК из плазмиды рГНвстраивание кодона для аланина вслед за АТГ кодоном, реклонирования в плаэмиду рВГН -1, трансформации полученным ЛНК штаммов Е. со 1 д с последуюплм выделением и очисткой конечного продукта, 1 э.п. ф-лы, 3 табл. Пример 1.а) Кодирующую соматотропин, т,е, бГР (Л) последовательность 71 НК, выделяют иэ рГН-1 как фрагмент Хва 1 и клонируют в сайт Хва 1 модифицированного вектора М 13 шр 8 (М 13 шр 8 /Хва 1), Хва 1 рассекает в обоих концах кодирующую бГР (Л) последовательность РНК, "вырезая" таким образом полную кодирующую бГР (Л) последовательность. Ллаэмиду рВГНек -1 после обработки Ферментом 1 смешивают в присутствии ЛНК-лигазы Т 4 с Рф ДНК (РФ - репликативная форма вектора) М 13 шр 8/Хва 1, линеаризованной при помощи эндонуклеазы рестрикции Хва 1, и обрабатывают щелочной фосфатазой иэ кишечника теленка (крупного рогатого скота). Затем смесь инкубируют в течение ночи при14 С, Обработка щелочной Фосфатазой из кишечника теленка (крупного рогатого скота) предотвращает рециркуляризацию вектора М 13 шр 8/Хва 1. Вставку кодирующей бГР (Л) последовательности ДНК в вектор М 13 тр 8/Хва 1 с целью образования рекомбинантного вектора М 13 шр 8/ВСН -1 первоначально контролируют образованием бесцветных бляшек на культуре бактерий 1 М 101 Е, со, выращиваемой на среде 1 п УТ, используя процедуру покрытия мягким агаром, который содержит 10 мл 100 мМ ИПТГ (изопропилП-тиогалактопиранозида) и 50 мкл 2 Ж (в/о) Х-САЬ (5- бром-хлор-индолил0-галактопиранозида) в 3 мл верхнего агара, и осуществляют трансфекцию упомянутым рекомбинантным вектором аналогично описанному, Вставку кодирующей бГР(Л) последовательности подтверждают при помощи рестрикции изолированной РФ ДНК рекомбинантного вектора ферментом Хва 1, в результатечего получают 25 Фрагмент в 590 пар оснований, содержащий вставленную последовательность. Фрагмент в 590 пар оснований идентифицируют при помощи электрофореза на агаровом геле в однопроцентном агаре. Все последующие фрагменты после обработки ферментами идентифицируют именно при помощи этой процедуры, Ориентацию вставленных кодирующих бГР (Л) последовательностей контролируют при помощи обработки РФ рекомбинатного вектора ферментами Яша 1 и Нпй 111. Если кодирующие последовательности находятся в правильной 5 -+ 3 ориентации, в результате сечения этими ферментами рестрикции получают Фрагмент в 207 пар оснований, Осуществляют изоляцию .однонитевой (ОН) ДНК фага, вектор М 13 шр 8/ВСНеиспользуют в качестве 45 матрицы прй сайт-специфическом мутагенезе,Олигонуклеотидную затравку, содержащую последовательность для искомой мутации, используют для эатравления синтеза конии замкнутой кольцевой ПНК матрицы М 13 шр 8/ВСН хонДНК, Полученные таким образом замкнутые кольцевые молекулы двунитевой (ДН) ДНК отделяют от неполных колец и колец онДНК при помощи центрифугирования градиентом щелочной сахарозы, Замкнутые кольцевые молекулы днДНК используют для трансформации Е. со 1 1 М 10 1 и полученные в результате бесцветные бляшки помещают на фильтры Пэлл и просеивают, контролируютгибридизацию в меченную Р Формуолигонуклеотидной затравки, использованной для осуществления сайтспецифического мутагенеэа, Фильтры промывают при увеличивающихся темпера"турах до тех пор, пока не исчезнетрадиоактивно меченный сигнал с контрольного Фильтра, который .приготавливают с использованием фага М 13 тр 8//ВСН-1. Промывку фильтров осуществляют при комнатной температуре вб х ЯЯС (0,9 М ИаС 1 0,09 М цитратанатрия) в течение 10 мин, затем при50 С в 6 Ф ББС в течение 5 мин, а последующие промывки - при увеличениитемпературы на 5 С. Бляшки, которыеогибридизировались с образованиеммеченной радиоактивным Элементом олигонуклеотидной затравки при температурах более высоких, чем контрольные фаги, считают несущими новую соз,данную кодирующую бГР (Л,Л) последовательность и называют положительными. Отдельные бесцветные бляшки отбирают из культуры трансформированных клеток 1 М 101 Е. со 1 д и выращивают,в 5 мл среды 2 х УТ 1,6 Х (в/о)триптона, 1,0 Х (в/о) экстракта дрожжей, 0,57. (в/о) НаС 1в течение ночипри 37 С в условиях аэрации. ДНК Фага затем наносят пятнами на нитроцеллюлозу, подвергают гибридизациис затравкой, меченной радиоактивнымэлементом, и промывают при увеличении температуры, как указано вьппе,ДНК Фага, которые имели температуругибридизации вьппе контрольных бляшекМ 13 тр 8/ВСНе, являются потенциально положительными,Потенциально положительные бляшки из обеих процедур выращивают ииспользуют для получения онДНК фага,анализируют последовательность онДНК, чтобы подтвердить, что она действительно несет кодирующую бГР (А,Л) последовательность. РФ ДНК М 13 шр 8/ /ВСНе(а 1 а) тоже анализируют, отбирают при помощи анализа ферментом рестрикции Нае 111 с тем, чтобы убедиться .в присоединении кодона аланина после комплекса сигналов начала кодон метионина АТС, так как при создании кодона аланина образуются дополнительные сайт-ограниченияНае 111, частота присоединения кодона5 164аланина составляет примерно 27. кодирующей .бГР (Л) последовательностиДНК,б( Конструкцию кодирующей бГР (А,В)последовательности ДНК отбор и анализ последовательности осуществляютаналогично описанному, но матрицейявляется М 13 шр 8/ВСНе(а 1 а), а олигоклеотидная затравка указана в табл. 1.Частота превращения кодона лейцина вкодон валина составляет примерно 102.В табл. 1 показано конструирова, ние кодирующих соматотропин с Е-концевым аланином последовательностей,в) Конструкцию кодирующеи бГР (В)последовательности ДНК, отбор и анализ последовательности проводят аналогично описанному. При этом матрицей является М 13 шр 8/ВСН -1, а олигонуклеотидная затравка используетсята же, что и при конструированиибГР (А,В). Частота превращения кодона лейцина в кодон валина составляет.примерно 107.,Используют олигонуклеотидный сайтспецифический мутагенез, чтобы присоединить кодон аланина к кодирующейсГР (Ф) последовательности ДНК.Кодирующую сГР (Ф) последовательность ДНК в 590 пар оснований, содержащуюся на плазмиде РРСНе, вы-деляют из этой плазмиды при помощиэндонуклеазого сечения ЕсоР 1 иНпЫ П 1которые рассекают плазмиду в 5 и 3концах кодирующей сГР (Ф) носледовательности. Рассеченную плазмидурРСН ,-1 смешивают с РФ ДНК М 13 шр 9,который разрезают эндонуклеазамиЕсоК 1 и Нпй ТП и предварительнообрабатывают щелочной фосфатазой изкишечника теленка (крупного рогатогоскота) с тем, чтобы предотвратитьповторную лигацию фрагментов рестрик- .ции М 13 шр 9. Затем в упомянутую смесьдобавляют РНК-лигазу Т 4, Благодаряналичию отклоняющихся от нормы концов на РФ РНК фага и кодирующейгГР (Ф) последовательности ДНК, образованных при использовании, двухразличных ферментов рестрикции, ДНКсГР (Ф) селективно вставляют в РФДНК Фага в правильной 5 -)3 ориента 4ции, Затем осуществляют трансформацию Е. со 1 1 М 101 в соответствии сописанием, приведенным выше дляМ 13 шр 8/ВСН -1, при помощи рекомбииантного вектора М 13 шр 9/РГН -1, не-сущего кодирующую сГ" (Ф) последо 6489 6вательность ДНК, Затем трансформированные Е. со 1 х 1 М 101 выращивают насреде 1 й УТ, содержащей колориметрические реагенты, и отбор осуществляют по образованию бесцветных бляшеканалогично описанному.Вставку кодирующих сГР (Ф) послену-довательностей .НК подтверждают следующим образом. Выбирают бесцветныебляшки, а РФ ДНК М 13 шр 9/РГНФрассекают эндонуклеазами ЕсоК 1 иНхпй 111и подвергают электрофорезу на агаровом геле, в результате чего получают15 Фрагмент в 590 пар оснований, содержащий вставленную ДНК с ГР (Ф), Затемфаг М 13 шр 9/РГН-1 размножают в Е.со 1 з 1 М 101, выделяют онПНК фага,,ПНК М 13 тр 9/РСН -1 используют в20 качестве матрицы для сайт-.специфического мутагенеза, как описано выше,конструирования кодирующей бГР (А,Л)последовательности, используя специальную затравку (табл. 1), Частота25 присоецинения кодона аланина, в данном случае ГСС, к кодирующей сГР (Ф)последовательности, составляет примерно 12 Е. Получение кодирующейсГР (А) последовательности.опдтверж-30 дают анализ последовательности ДНК,П р и м е р 2. Получают три нолипептида, соматотропины видов бГР (А,Л), бГР (А,В) и сГР (А).Кодирующие бГР (А,Л), бГР (А,В)и бГР (В) последовательности ДНК,содержащиеся на рекомбинантных векторах М 13 шр 8/ВСРех(а 1 а),М 13 шр 8/ВГН -1 (а 1 а, ча 1) и М 13 шр 8//Всех(ча 1), соответственно используют для замены кодирующей бГР (Л)последовательности,ПНК, содержащейся на плазмиде экспрессии рВГН -1.ехЭто осуществляют при помощи переваривания соответствующих РФ ДНК М 1345 ферментом Хва 1, Плазмиду экспрессиирВГНЕпереваривают эндонуклеазойХва 1, а затем обрабатывают щелочнойфосфатазой из кишечника теленка(крупного рогатого скота) с тем, что 50 бы предотвратить повторную лигациюфрагментов рестрикции. Каждую изпереваренных РФ РНК смешивают с переваненой ПНК рВГН -1 и подвергаютлигации в течение ночи при 14 С.,5.Полученные таким образом рекомбинантные векторы экспрессии, которые обозначают рЮИ 3209, рМОН 3215 и рМОИ32 14, несут кодирующие бГР (А,Л),бГР (А,В) и бГР (В) последовательнос 1646489ти,пНК соответственно, Затем Е. со У 3110 подвергают трансформации ,смесью, содержащей рМОЮ 3209 или рМ 011 3215, или рМОЮ 3214, или рВСРех-Т, и выращивают в бульоне Лауриа (БЛ), содержащем 17 (в/о) триптона, 0,57 (в/о) экстракта дрожжей и 0,57, (в/о) НаС 1, а также 12,5 мкг/мл тетрациклина и 200 мкг/мл ампициллина. Штамм Е, соТ 1 М 3110 с плазмидой рМОУ 3209 задепонирован под номером АТСС 53024 Штамм Е, со М 3110 сплазмидой рМОЯ 3215 задепонирован под номером АтСС 53022,Трансформацию осуществляют следующим образом. Приблизительно 50 мл культуры Е, со 11 Ы 3110 выращивают в среде БЛ до ОП 600=0,60. Клетки извлекают в виде таблетки и вновь суспендируют в 10 мл буфера А, содержащего 25 м 1 трис, рН 7,6, и,10 ьУ ВаС 1. Затем клетки извлекают в Форме таблетки и вновь суспендируют в 1 мл буФера А, в который добавляют 14 мл . 25 буФера В, содержащего 25 мИ трис, рН 7,6, 10 М 1 ЮаС 1, 50 мМ СаС 1, и суспензию инкубируют на льду в течение 30 мин. Далее клетки извлекают в Форме таблетки и вновь суспендиру ют в 3 мл буфера В. Порцию в 0,2 мл суспендированных клеток вновь смешивают с О, 1 мл буфера В и 0,1-0,5 мкгрекомбинантным вектором экспрессии (рИОИ 3209 или рМОИ 3215, рМОИ 3214 или ВГИе-Т) и инкубируют на льду В течение 60 мин. Затем инкубированную смесь нагревают на 1 мин при 37 С, после чего добавляют 3 мл среды БЛ, Далее полученную в результате смесь инкубируют в течение 60 мин при 37 С. Клетки извлекают в Форметаблетки и вновь суспендируют в 300 мп среды БЛ и выращивают на пластинках с БЛ, содержащих вышеназваннные антибиотики, Далее отбирают стой кие колонии и выделяют ДНК векторов экспрессии рМОН 3209, рИОИ 3215,РВСН -Т и рМОИ 3214. ДНК рМОЮ 3209,рМОИ 3215, рВСРех-Т и рИОН 3214 анализируют на наличие Фрагмента ХваТв 590 пар оснований и фрагментаИыд ТТ 1/Бша 1 в 200 пар оснований,подтверждающих наличие кодирующихбГР (А,Л), бГР (В) и бГР (А,В) последовательностей ДНК в правильнойориентации, Далее плазмиды экспрессиирМОИ 3209 и рИОН 3215 анализируют при помощи анализа эндонуклеазами рестрикции (Пае ТТТ) с тем, чтобы убедиться в присутствии нового сайта Нае ТТТ, образовавшегося при присоединении кодонаГСС (аланина). Фрагмент ХваТ в 590 пар оснований из векторов рМОИ 3209, рМОИ 3214 и рМОМ 3215 анализируют на состав последовательности с тем, чтобы подтвердить присутствие в этих векторах экспрессии кодирующих для бГР (А,Л), бГР (В) и бГР (А,В) последовательностей ДНК.Отдельные колонии Е. со 11 И 3110, несущие нлазмиды рМОИ 3209, рИОЯ 3214, ВГНе -Т или рМОГ 3215, помещают в 5 мл БЛ, содержащего 12,5 мкг/мл тетрацнклина, и выращивают в течение ночи при 37 С при аэрации, После че-. го 0,5 мп каждой культуры используют для выращивания отдельно на 25 мл среды И 9, содержащей (на 1 л среды) 100 мл солей (70 г Иа ПРО, 30 г КН РО+, 5 г РаС 1, 10 г ИР 4,С 1 на 1000 мл общего объема), 1,2 мл 1 М раствора Мд 304 0,25 мл 0,1 Х-ного В, 12,5 мл 2 ОХ-ного (в/о) раствора глюкозы, 0,025 ип 1 М раствора СаСТ дополненной 0,5 Е (в/о) казаминовйх кислот и 6,25 мкг/мл тетрациклина и содержащейся в 250-миллиметровой колбе, Каждую культуру. выращивают при 37 С в условиях аэрации до тех пор, пока ОП 600 (оптическая плотность в диапазоне 60" нм) не достигнет 1,0, Далее 0,2 мл извлекают из каждой упомянутой колбы и отдельно подвергают лизированию в буФере додещюлсульфатнатрия (ДСН) полиакриламидного гелевого электрофореза (ПАГЭ) и и анализируют методом ДСН-ПАГЭ, Протеины с молекулярным весом 22000 дальтон в высоких концентрациях получают в культуре Е. со 11 У 3110 для обеих генетических конструкций, Клетки культуты Е, со 1 х У 3110, несущие нлазмиду рВК 322, не продуцируют протеин в 22000 дальтон, который связывается с антителами антисоматотропина.Бактерии, несущие плазмиды рМОИ 3209, рМОО 3214, рВГН -Т и рМОИ 3215 хранят следующим образом. Каждую колонию культуры Е. со 1 И 3110, трансформированную при помощи только одной плазмиды (рМОВ 3209 или рМОИ 3215, рМОИ 3214 или рВСНе-Т),о выращивают в течение ночи при 37 С в 5 мл БЛ плюс 12,5 мкг/мл тетрациклина при аэрации, Порцию в 1 мл каж 9 1646489 10дой культуры после выращивания в течение ночи добавляют отдельно в индивидуальные колбы, содержащие 25 млБЛ плюс 12,5 мкг/мл тетрациклина ивыращивают до достижения ОП 600"1,0,5Затем клетки из каждой колбы собирают центриугированием при ускорении 6000 х я при 4 С в течение 5 минтаблетки. Отдельно суспендируют снова в 12 мл БЛ плюс 7 5 й (в/в) ДИСО иочень быстро эамораживают на сухомльду порциями.в 1 мл. Далее клеткихранят в холодильнике с жидким азотом. 10 мкг очищенной ДНК плазмндыхранят при -80 С.Кодирующую сГР (А) последовательность, содержащуюся на рекомбинантном векторе М 13 шр 9/РСН-1 (а 1 а)используют для того, чтобы .заменитькодирующую 6 ГР (Л) последовательность ДНК, содержащуюся на модифицированном векторе экспрессии РВСН-Х,Модифицированный вектор экспрессииРВСН-1, является вектором экспрессни РВСНех-Х, в котором сайт ограничения Есо 21, расположенньй вверхот промотора триптофана (рог р), .удален. Модифицированный вектор экс прессии РВСНехконструируют при 30помощи частичйого переваривания Ферментом ЕсоКХ РВСН хс последующейобработкой нуклеазой 81 с тем, чтобы удалить липкие концы, ВекторРВСН -Х после рестрикции подвергаех 35ют рециркуляризацин с использованиемДНК-лигазы Т 4, а затем используютдля трансформации культуры Е. со 1 ЛИЭ 1. Все зто осуществляют в соответствии с описанным ранее. ДНК 40нлазмиды из каждой колонии анализи,руют на наличие Фрагмента ЕсоК 1//Нпд 111 в 590 пар оснований, несущего кодирующую сГР (А) последовательность, н Фрагмента Есор/ 45/Рзй 1 в 1050 пар оснований, несущего последовательность РСг р. Удаление этого ЕсоКХ сайта рестрикцииупрощает сайт-специфическую вставкуспециального сайта кодирующей. сГР (А)последовательности в вектор экспрес 50сни РВСНхв правильной ориентации,Рекомбинантный вектор экспрессии,полученный таким образом, в дальнейшем обозначают РМОБ 3213. Смесь, содержащую РМОН 3213, используют длятрансформации культуры Е. со 11 Ю 3110,затем трансформированные клетки выращивают и подвергают селекции:Кульура 1, со 1 и 3110 ф содержащая РМОН 3213, денонирована под номеромАТСС 53023. Замену кодирующейсГР (Л) последовательности кодирующей сГР (А) последовательностью в векторе экспрессии РВСН -1 цодФек тверждают при помощи выделения дНК РМОИ 3213 и последующем сечении упомянутого вектора экспрессии эндонуклеазами ЕсоК 1 и Нпд 1 П и получают Фрагмент в 590 пар оснований, а се- . чение с использованием Нае П 1 показывает присутствие дополнительного. Нае 111 Фрагмента рестрикции, который образуется из-за присутствия кодака аланина в кодирующий сГР (А) последовательности ДНК. Окончательное подтверждение присутствия кодирующей сГР (А) последовательности ДНК в векторе экспрессии РИОНИ 32 13 получают при помощи частичного анализа последовательности Фрагмента ЕсоКЕ/Нхпй 111 в 590 пар оснований.Экспрессию коднрующей сГР (А) последовательности ДНК и продуцирование сГР (А) в культуре Е. со 1 х 03110 ,осуществляют прм помощи тех же приемов, которые бьющ описаны ранее и использовались при .получении бГР (А, Л) и 6 ГР (А,В). Аналогичным образом получают высокие .концентрации протеинов в 22000 дальтон, что устанавливают при помощи анализа ДСН"ПАГЭ.Клетки Е. со 11 У 3110, несущие вектор эксперссии РИСИ 3213, хранят так же, к%к описано ранее и используют для получения в больших количествах сГР (А) (Ферментацию осуществляют в 10-130.-литровых емкостях=. Содержание протеина сГР (А) в реакто ре"Ферментации емкостью 100 л состав-. ляет приблизительно 1 г/л, бульона.П р и м е р 3. Соматотропные палипептнды, синтезированные в культуре Е. со 11, подвергают очистке из неочищенных солюбилизированиых светопреломпяющих тел, содержащих один из 6 ГР (А,Л), бГР (А,В), шей в . бГР (В)шей - бГР (Л) или сГР (А) при помощи иммуноадсорбентной хроматографии. Все три вида соматотропина, очищенные при помощи иьмуноадсорбентной хроматографии, имели чистоту, превЫ- шающую 953. Этот Факт устанавливают при помощи анализа ДСН-ПАГЭ с использованием 1 мг очищенного протеина на 7,5-153-ном (в/о) градиентном геле. Концентрации протеинов очищенных ви 1646489дов бГР определяют при помощи известного анализа с использованием высокоразрешающей жидкостной хроматографииПротеины, очищенные при помощихроматографии, основанной на принципе иммунного средства, для использоВания в анализе на Н-концевую последовательность, подвергают диализу доПолного удаления воды, а затем лиофилизируют. Перед выполнением анализаЙ-концевой последовательности очищенные протеины снова суспендируютв буфер бикарбоната аммония, содержащий 50 мМ бикарбоната аммония плюс0,1 Я (в/о) ДСН, и подвергают диализу против того же буфера с тем, чтобыудалить остаточные трис/оксиметил//аминометан/трис/ и глицинВ табл. 2 приведены результатыанализа И-концевой последовательностей для нескольких препаратов поли-.пептидов бГР (А,Л), бГР (А,В), шеС -бГР (В), тпес - бГР (Л) и сГР (А) . 25Количество протеина с М-концевым метионином приведено в процентах от общего содержания соматотропина в пробе, Для определения количества метионина используют два метода. Припомощи непрямого метода количествоИН -ше-а 1 а-рЪе в преобладающейпопуляции НН-а 1 а-рЬе вычисляютисходя из различий в 1 ае-сигналах.Так как зта процедура зависит отнекоторой оценки нормального запаздывания для последовательности, которое изменяется от цикла к циклу,она является лишь весьма грубой оценкой для содержащейся последовательности НН-а 1 а-рЬе Прямой метод,содержащий реакцию молекулярной деградации Эдмана, заключается в сравнении мощности сигналов от РТН-шейотносительно РТН-а 1 а после отделения РТН-ше от химического шума с,использованием высокоразрешающейжидкостной хроматографии (ВРЖХ). Вчастности, реакция деградации Эдманазаключается во взаимодействии Мконцевой аминокислоты с реагентом,который отсекает эту аминокислоту,и в ее последующем высвобождении вформе РТН-производного этой аминокислоты, Последняя процедура будет да 5 свать хорошие оценки (%) для те-а 1 арЬе в том случае, если загрязнение свободной аминокислотой является низким,Степень обработки И-концевого метионина варьирует в клетках от ферментации к ферментации, но всегда происходит в не менее 80% от всех молекул соматотропина,П р и м е р 4, В табл. 3 показано изменение надоев молока, вызванное инъекцией солюбилизованных видов бГР коровам. Из полученных данных видно, что бГР (А,В) и ше-бГР стимулируют надои молока в гораздо более значительной степени, чем соответствующие им (содержащие лейцин) аналоги бГР (А,Л) и щеС-бГР (Л) . Кроме того, испытываемые валиновые бГР- виды при совместном сопоставлении с лейциновым бГР-видами дают в статистическом смысле (р=0,02) более значительный прирост. надоев молока.Исследование проводят следующим образом.Коровам породы Холстейн в период их второго и третьего триместра лактации дают 5 мл раствора бикарбоната натрия (рН.9,8+0,5), только (контроль) или содержащего примерно 25 мг бГР (А,В), бГР (А,Л), ше 1- бГР (В) или спей - 6 ГР (Л) (в дальнейшем все эти смеси вместе именуются испытуемыми соматотропинами), ежедневно. Все испытуемые соматотропнны и контрольные пробы применяют парентерально при помощи внутрнмьппечнойинъекции в полусухожильную мьппцу еже.- дневно в течение 21 дня. Фиксируют . ежедневный удой каждой коровы, начи- ная эа шесть дней до первой ежедневной инъекции и на протяжении 21 дня, в течение которых делали инъекции, Анализируют каждую жирность, содержание протеинов в молоке и соматические клетки. Результаты, представленные в табл. 3, указывают, что увеличение надоев молока, полученное при применении бГР (А,Б) к коровам, примерно на 503 вьппе, чем полученное при использовании бГР (А,Л) и примерно на 173 выше при применении шей - бГР (В),чем при применении шефов бГР (Л).Формула изобретения Способ получения бычьего гормона роста, включающий получение кДНК, кодирующей бычий гормон роста, встраивание кДНК в бактериофаг, трансформацию полученными рекомбинантными фагами штаммов ЕзсЬегсЬха со 1, от1646489 отношении стимуляции лактации у коров,-Ъ фрагмент кДНК, выделенный из плазмиды рГН"1, с помощью сайтспецифического мутагенеза встраивают ,кодон для апанина вслед за АТС кодоном и полученный модифицированный фрагмент реклонируют в плазмиду рВСНевместо последовательности ДНК, кодирующей ВОН (Ь).1 2. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и й с я тем, что бычий гормон представляет собой ВСН (А,Ч) . Таблица 1 Обозначение Затравочная последовательность протеина Матрица Обозначение плазиидыПроба Непрямой Прямой 92.,020,310,87 5+%16,716,7Не выполнялся спей-бГР (Л)бГР (А,Л) бГР (А,В) сГР (А)пьей-бГР (В)в ШВ1 Количество протеина с И-концевымметионином проведено в пересчете напроценты от общего содержания соматотропина в пробе,+Данные для протеина, очищенногопосле проведения двух отдельных ферментаций,бор клонов, содержащих рекомбинант. ные плазииды с геном бычьего гормона, выделение рекомбинантных плазмид и встраивание. кДНК из этих плаэмид в вектор экспрессии с последующей трансформацией полученной плазмидой экспрессии штаммов Е. со 1, отбором ,трансформированных штаммов, культивированием в питательной среде, выделением и очисткой конечного продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения биологической активности бычьего гормона роста в 100,018, 4 ффс 6,01646489 Таблица 3 Вероятностьзначимости Недели исследования Измененияотносительно контроля Процент нзменеОбработка 1 ислокоровв каж 2 3 ния относительно контроля дом ис- пытании Контр.ЬСН (А, Ч)ЬСН. (А,Ь)ше 1 . - ЬСН (Ч)пег. - ЬСН (1.)ЬСН (А,Ч),ЬСН Ь,1)1 тпеС - ЬСН (Ч)тле - ЬСН (1)Ча 1 1.ео 10 9 9 8 9 25 ф 5 24 эб 26 0 254 322 33 1 3617 340 29,9 30,2 33,5 3 1,2 3 1, 6 33, 8 35, 8 33,7 31 О 32 1 34 2 32 5 33,9 22,8 32,7 28,0 8,6 5,8 8,3 7,1 р=0,02 р=0,33 р=0,02 П р и м е ч а н и е, Значения приведены в пересчете по методу наименьших квадратов(в килограммах) на корову (в день) молока с нормализованной жидкостью в 3, 5 Ж жира,Составитель Н,.КуэенковаРедактор М,Петрова Техред С.Мигунова Корректор И.Эрдейи Заказ 1353 Тираж 382 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101