Способ количественного определения 5-гидроксиизофлавонов

) С 01 И 30/ Ь 104 ель.Н Сл СЬ пределение органах кл зе, - Физи кул 1, ия 19 т. ных растес. 46.- повышение точ ости определени ь изобретении чувствителускорение.имер 1. Цности тся к способу Изоброличест ение обнос нного опре нов, котор в анализе еления 5-гидрокй может найтилекарственных ивых препаратов,и егоП р изо ав Определв клевер е содерадино. примене кормовых охании ни рав, гале ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИЯМПРИ П(НТ СССР А ВТОРСНОМУ СВ(56) Вгаяяецг Т., Апяепосе 1 Ап апп.поесйапо 1. й 1 рНепу 1 Ъогасе - РЕС 400 .шхсцге: Ап 1 псегеяс 1 щ геаяепс акогЬ 1 ачопоЫ десегш 1 пас 1 оп. - 3. СЬготасодг. 1986, ч. 351, У 2, р, 251.РеИ 1 о И С 1 агЕ К.11, ВосЬап 1 пА апй Гогшопопес 1 п сопсепс 1 п гейс 1 очег чаг 1 есея ас вечега 1 шасцгсувсаяев. - Сап, 1, Р 1 апс Бс 1, 1968,ч. 48, В 2, р. 175,Сцгпо Р,Н Оеясгодеп 1 с ассдч 1 суог вцЬсеггапеап с 1 очег. ТЬе 1 во 1 ас 1 оп ой 8 еп 1 яседп Егош вцЬсеггапеапс 1 очег апй тесЬос 1 я оЕ ццапсдсасдчеевс 1 шас 1 оп. - В 1 осЬеш. Л. 1954, ч. 58,Р 2, р. 283Агаев Фи др. Динамика и расУ 1фитоэстрогеновв наземныхевера лугового в онтогене(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 5-ГИДРОКСИИЗОФЛАВОНОВ(57) Изобретение касается аналитической химии, в частности количественного определения 5-гидроксиизофлавонов,может быть использовано в анализе лекарственных и кормовых трав. Цельповышение точности и чувствительностианализа при сокращении его длительгности, Анализ пробы ведут экстракциейи очисткой фенольных соединений, иххроматографическим разделением на закрепленном слое силикагеля и проявлением 5-гидроксиизофлавонов с помощью 407-ного раствора эфирата ВРз.Затем проводят элюирование продуктаконцентрированной СНзС(О)ОН,содержащей 0,06 - 0,38 мл 407-ного раствора ВР. в диэтиловом эфире на 10 млСН С (0) ОН, и полученный элюат подвергают флуориметрированию. Эти условия повы-шают точность анализа в 4-6 раз,чувствительность в 2 - 3,5 раза при меньшемв 2,3 - 3,4 раза времени определения,чем в известном случае, 10 табл.Фиксированное растительное сырье высушивают, измельчают, отбирают навески 10 г. Экстрагируют растительный материал 40-50 мл 90 -ного этанола на глицериновой или водяной бане- 60-70 С) в колбе с обратным холодильником в течение 20-30 мин. Экстракт отделяют, а растительный ма - териал снова заливают этанолом. Извлечение повторяют 4-5 раз, полученные экстракты объединяют, отфильтровывают и упаринают до водного остатка. Последний очищают в делительной воронке 5-6 порциями (по 50 мл) петролейного эфира до тех пор, пока органическая фаза не станет бесцветной или слабо-желтой. Очищенный водный остаток упаривают на роторном вакуумном испарителе почти досуха, затемо гидролизуют его при нагревании (100 С)в течение 3 ч с 5-10 мл 10 -ной серной кислоты.Агликоны фенольных соединений извлекают из гидролизата 5-6 порция ,ми этилацетата. Этилацетатные экстракты объединяют, упаривают досуха, растворяют сумму фенольных соединений в 5 мл метанола. Апиквоту 0,05 мл метанольного раствора наносят в виде полосы на хроматоГрафическую плас,тину "Силуфол", предварительно очищенную метаНолом и активированную прио нагревании в течение 30 мин при 120 С. Справа и слева от полосы фенольных соединений Наносят пятна меток-свидетелей (биоханина А) . Разделение проводят в камЕрах с насыщенной атмосферой в системе растворителей хлороформ + метанол + вода( 95-5-0,5), 40По окончании разделения пластинку, сушат на воздухе 5-10 мин, затем опрыскивают 40 -ным раствором эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире, Полоса, содержащая биоханин А, приобретаетв УФ-свете желто-зеленую флуоресценцию, в видимом свете, если изофлавона много, - светло-желтую окраскуфФлуоресцирующую в УФ-свете полосу очерчивают, соскребают силикагель с анализируемым веществом с хроматографической пластинки и заливают его 0,1 мм раствора эфирата ВР и 8 мл концентрированной уксусной кислоты. Смесь периодически встряхивают в те чение 25 мин, отфильтровывают от адсорбента и флуориметрируют Я О, =254 нм, Ъ и 0 = 580 нм). Параллельно проводят аналогичные процедуры для получения стандартного и фонового растворов. Содержание 5- гидроксиизофлавона опредепяют го фор- муле У 11 хСо Ф у - ФРХ =х ,Ф - Ф 1,где 1 - объем метанола для растворения суммы фенольных соединений, мм;М - молекулярная масса изофлавонов, г/моль;С - концентрация стандартного ра 0створа, моль/л;навеска растительного материала, г;Ф- флуоресценция исследуемогораствора;Ф - флуоресценция стандартногораствора;Ф - флуоресценция фонового раствора;Х - содержание 5-гидрооксиизофлавона в растительном материале, мг/г.Содержание биоханина А в клевереладино составляет, мг/г: по известному способу - в листьях 1,360, в стеблях 1,331; по предлагаемому способу -в листьях 0,310, в стеблях 0,970,П р и м е р 2. Определение генистеина и софорикозида в сумме фенольных соединений из Софоры японской.Сравнение точности предлагаемого способа и известного.1 О навесок, содержащих 0,7-0,9 гсуммы фенольных соединений, и 10 таких же навесок с добавлением гени-.стеина в количестве 0,5 кг/г и софорикозида 1 мг/г растворяют в )О.млметанола. 0,1 мл раствора наносят нахроматографическую пластинку вместес метчиками 5-гидроксиизофлавонов.Разделение проводят в системе растворителей хлороформ + метанол 75-25,.Кгенистеина 0,69+0,02, софорикозида0,32 ФО,ОЗ, По окончании разделенияопрыскивают пластинку раствором эфирата ВГ, под УФ-светом очерчиваютфлуоресцирующие зоны и соскребают ихс подложки. Элюирование проводят какв примере 1. Флуориметрируют с использованием стандартного и фоновогорастворов (табл. 1 и 3).Параллельнопроводят определение по известномуспособу с использованием спектрофотометрии (табл, 2 и 4).51015 11 ри определении генистеина нахроматографической пластинке в зонеК = 0,60-0,75 мало мешающих Фенольных соединений. Однако, вследствиеневозможности полного удаления 5-гидроксиизофлавона, выход его в известном способе на 15,9 ниже, чем впредлагаемом, точность предлагаемогоспособа в 4,3 раза вьппе.1При анализе софорикозида наблюдается большое количество мешаюших фенольных соединений, что приводит вслучае известного способа к завышениюрезультатов (10,3 ). Точность предлагаемого способа в 6,4 раза выше, чемизвестного. Низкий выход внутреннегостандарта в известном способе объясняется одновременным влиянием двухфакторов - большим количеством примесей и неполным удалением с пластинки анализируемого компонента.П р и м е р 3, Приготовлениестандартного и внутреннего растворовсравнения,0,1-0,2 мл раствора известной концентрации наносят на пластинку и подвергают хроматографическому разделе-,нию как в примерах 1 и 2. Элюированиеи флуориметрию проводят так же, какдля анализируемых растворов . Фоновыйраствор приготавливают по указаннойметодике из чистого силикагеля, удаляемого с пластинки, с площади, примерно равной площади полос анализируемых на хроматограммах 5-гидроксиизофлавонов, .Использование фоновыхрастворов необходимо на однолучевыхфлуориметрах. В двулучевых приборахФоновые растворы использовать не нужно: флуоресценция фона учитываетсяавтоматически.П р и м е р 4. Выбор реактивадля идентификации 5-гидроксиизофлавонов на хроматографических пластинкахСилуфол .Дпя определения предела обнаружения проявляющих реактивов растворыгенистеина, наиболее Часто встречающегося представителя 5-гидроксиизофлавонов, наносят на хроматографические пластинки в виде полос, содержащих.195, 100, 50, 40, 20, 10, 8, 5,3 мкг.Результаты определений представле;ны в табл, 5.Из табл. 5 видно, что эфират ВРэявляется наиболее чувствительным реактивом для идентификации 5-оксииэо 20 25 30 35 40 45 50 55 4 яанонов, в частности его открываеимый минимум" в 4 раза ниже, чем у резактива, используемого в известномспособе, В случае идентификации гликозидов, например софорикозида, наблюдается дополнительное увеличениефлуоресценции, вероятно, за счет реакции между эфиратом ВР и гликозидной частью молекул определяемых веществ,П р и м е р 5. Использование эфирата БР для количественного анализа5-гидроксиизофлавонов,5.1. Зависимость интенсивностифлуоресценции от количества добавленного 40%-ного раствора эфирата три.Фторида бора в диэтиловом эфире.0,2 мп раствора генистеина (1 г/л)в метаноле приливают к 8 мл концентрированной уксусной кислоты (концентрация генистеина в полученной пробе24,4 мкг/мп), Затем к полученным таким образом пробам, добавляют различные объемы раствора эфирата ВР . Такие же количества реагента приливаютк 8 мл уксусной кислоты, несодержащей изофлавона. Этот раствор используют в качестве фонового. На основепроведенных исследований установлено,что оптимальное количество эфиратаВР 0,05 - 0,3 мл на 8 мл уксуснойкислоты (0,06 - 0,38 мп на 10 мл кислоты).Данные приведены в табл . б.5.2. Устойчивость флуоресцирующего комплекса во временй.Готовят флуоресцирующий раствор,состоящий иэ 8 мл концентрированнойуксусной кислоты, 0,1 мл раствораэфирата ВР и 0,2 мп раствора генистеина в уксусной кислоте, несодержащий эфирата ВР . Стрелку флуориметраустанавливают на значение 100% и измеряют зависимость флуоресценции отвремени,Из табл . 7 следует, что в течение30-35 мин флуоресценция раствора неизменяется. За это время в процессеанализа 5-гидроксиизофлавоны элюируют с адсорбента, фильтруют элюат иизмеряют его флуоресценцию.5.3. Зависимость интенсивностифпуоресценции от концентрации генистеина.В раствор, содержащий 8 мп уксусной кислоты и 0,1 мл эфирата ВР , добавляют 0,2; 0,1; 0,05 0,02; 0,005 мпраствора генистеина в метаноле1576859 щ и й с я тем, что, с целью повыше-,.ния точности и чувствительности определения и его ускорения, проявлениепроводят 40 Е-ным раствором эфирататрифторида бора в диэтиловом эфире,в качестве элюента используют концентрированную уксусную кислоту, содержащую 0,06-0,38 мп 407.-ного раствора эфирата трифторида бора в диэтиловом эфире на 10 мл кислоты, иполученный элюат подвергают флуориметрированию. пользованием экстракции в 2,3-3,4 раза) меньше, чем в известном . Формула изобретения Способ количественного определения 5-гидроксиизофлавонов, включающий экстракцию и очистку фенольных соединений, их хроматографическое разделе ние на закрепленном слое силикагеля, проявление 5-гидроксиизофлавонов, элюирование их,из силикагеля органическим растворителем, о т л и ч а ю Таблица 1Ф) -Ф ) -- -тФе фу д д Ф-Фф Фс ф)1) Внутренния г станВыходвнутреннего Х дарт мг/г стандарта Х 0,778 0225 0,830 0,238 0,844 0)248 0840 0,244 0,872 0,2540855 0,247 О,Е 41 О,254 0,852 0262 0,831 0,241 О, 859 0)256 0,5 П р и м е ч а н и е. Дисперсия 0,069, коэффициент вариации 440" Таблица 2 Внутренний стандарт,мг/г ВыходвнутренА х,А него стандарта, Х1576859 Таблица 3Е фс фу а а фа-ф ч фс фт Внутреннийстандарт,мг/г Вмкодвнутреннего гтандарта, Х 0,934 3, 750 0,764 3,017 0906 3,600 0773 3016 0,847 3,450 0,756 3)100 0,853 3,550 0,917 3,767 0,821 3,300 0853 3,483 О, 830 0,844 0,840 0,874 78,72+1,10 1,О 0,8550,778 0,841 0,852 0,831 0,859 11 р и м е ч а и и е. Дисперсия 2,058, коэффициент вариации 18 Х. Та блица 4 Вмкодвнутреннегостандарта Х Внутренний стандарт,мг/г 78,4397,2294,2989, 3972,58 86,8616 4383,5787,5181,56102,3281,74 1,0 87)261569 40 П р и м е ч а н н е. Дисперсия 74,21, коэффициент вариации 115 Х, Оптическую плотность определяют раэбавлением фотометрируемого раствора в О раэ. Таблица 5 Способ идентификации Условия наблюдения и наблюдаемый признак ОткрываеМЫИ МИНИ Стандартныйоткрываемыйминимум,МКГ/См мум В по ЛОСЕ,МКГ Визуальная идентификацияГо же В УФ-свете (253 нм) темнаяне флуоресцирующая полосаВ УФ-свете (253 нм) в присутствии фенольных соединений клевера ладиноВ видимом свете светло-коричневая окраска 1 О 0,9 20-40 1,8-3,6 Самопроявление поддействием УФ-светав теиение 1 ч 50 Опрыскивание 01%- ным РеС 15 в зтяноле Б видимом свете светло-коричневая окраска 20 0,917 0,773 0,934 0,821 0,906 0,764 0,847 0,853 0,756 0,853 4,90 5,12 6,00 5,00 4,48 4,35 505 4,74 5,27 4,78 78,36 77 06 77,55 76,7 78,49 80,03 822 80,17 78,45 79, 69 0,830 0,844 0,840 0,872 0,855 0,778 0,841 0,852 0,831 0,859 3,400 3,500 3,383 3,567 3,533 3,183 3,450 3,400 3,350 3,533 4,2 5,29 5,35 4,48 4,99 4,31 5,68 5,41 4,8 4,98 79,9480,9378,6179,8380,66 7969+092 97 79,8580,0677,8878,6880,28 7340 92,68 9417 88,86 86,30 80,87 99,86 9389 85,59 86,633 1576859 1 родолжение табл.5 Опрыскивание 0,17. -ным ЕгОС 1 в метаноле В УФ-свете желто-зеленаяфлуоресценция 40-50 3,6-4,5 50 Опрыскивание 0,17 ным ЕгОС 1 в метаноле В видимом свете светло-желтая окраска В УФ-свете (253 нм) желтаяфлуоресценция 4,5-9,0 50-100 Опрыскивание 0,57.-нымА 1 С 1 в метаноле . 20 1,8 В видимом свете красно-коричневая окраска Опрыскивание раствором диаэосульфаниловой кислоты в 157 ном БаСО В видимом свете желтая ок 1,8 20 Опрыскивание смесьюхлорсульфоновая кислота + хлороформ 4+1 раска 1,8-3,6 20-40 0,01 М йода в 0,025 Мрастворе К. в воде В видимом свете коричневаяили желтовато-коричневая окраска Опрыскивание 17-ным В Уф-свете (360 нм) желтаядифенилборным эфиром флуоресценцияаминоэтанола и 5%-ным 0,9-1,8 10-20 полиэтиленгликолем400 в метаноле 1,8-3,6 20-40 В видимом свете светло-желтая окраска 0,3-0,5 В УФ-свете (253 нм) яркая . 3-5желто-зеленая флуоресценция 1Таблица 6 Количество, мл, раствора эфирара ВГ на 8 мл уксусной кислотыТо же, на 10 мл уксусной кислотыИнтенсивность флуоресцен в . ции:в абс. единицах в % Т а блица 7 30 35 40 45 1 5 10 15 20 Время, мин Интенсивность флуоресценции, % 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 97,8 94,4 93,3 Опрыскивание 40%-нымраствором зфиратаВГэ в диэтиловомэфиреТо же 0,00 0,03 0,05 0,20 0,30 0,40 0,50 1,00 0,00 0.,04 0,06 0,25 0,38 0,50 0,63 1,25 3 15 35 35 35 34 34 298,6 42,8 100,0 100,0 100,0 97, 97,1 82,41 б 576859 Таблица 8 О;О 3:7 5;5 7:3 8:г 9: 1 О:О 00 100 130 200 280 350 3550,0 28,5 37,1 57,1 80,0 100,0 100,0 Т а б л и ц а 9 Время элюнрованияГенистеин (агликоя) извлечение, Ха 1Софорикоэид, (1 лнкоэид) извлечение, Й 25,7 444 Таблица 10 Иродолжительность, мин, по способу Условия проведения опера"ции Операция известному предлагаемому Экстракция н очистка экс- Экстракция на водянойтрактов , бане, с 70 С 270-450 450 Разбавление сумьы фенольнюх соединенйй Камера для ТСХ, хроматотграфические пластинки"Силуфол" Хроматографнческое разделение 30 30 1 О 1 О Сушка и проявление Элюирование 720 25 фильтр - синяя илн желтаялента 1 О Фильтрование 1 О Фотометрирование Собственно анализ 785 90 Анализ + экстракция и очистка фенольных соединений 1230 355-535+ Ири определении гликоэидов стадия тидролиэа отсутствует. Составитель СХованскаяРедактор И.Горная Техред М,Дидык Корректор ОКравцова Заказ 1845 Тираж 498 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 Соотношение СН СООН:СНэонФлуоресценция анализируемого раствораХ извлечения вещества Удаление адсорбента схроматографическойпластинки и перемешивание с элюентом 10 15 20 2530 48,5 60,0 82,8 100,0 100,0 61, 1 72, 2 83, 3 100,000, О В известном способе спектрофотометр СФв предла;гаемом способе флуориметрЭФ-ЗМА