Способ биоиндикации тяжелых металлов в морской воде

(21 (22 (46 (71 (7 носоваЕ,Е.Гавриленк диционны юм море. Киев: 1 Х примеения в ка- зобре стианал ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИжЬРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИПРИ ГКНТ СССР.окружающей среды и может быть нено в контроле уровня загрязнморской среды тяжелыми металла использованием макроводорослей честве тест-организмов. Цельютения является повышение точноределения, сокращение времени Изобретение относится к области охраны окружающей среды и может быть применено в контроле уровня загрязнения морской среды тяжелыми металлами с использованием макроводорослей в качестве тест-организмовЦель изобретения - повышение точности определения, сокращение времени анализа и увеличение количества одновременно анализируемьх проб.Способ заключается в следующем, Биомассу водорослей - тест-объектов помещают в камеру с чистой водой и проводят адаптацию растений к фоновому содержанию тяжелых металлов за и увеличение количества одновременно анализируемых проб. Способ заключается в том, что водоросли (тестобъекты) адаптируют в течение сутокна среде с Фоновым содержанием металлов при красном свете интенсивностью300-500 лк, Затем среду заменяют исследуемыми образцами воды (опьгг) исвежей исходной средой (контроль) ив течение 28-30 ч водоросли инкубируют при периодическом освещении интенсивностью 6000-8000 лк (4-4,4 чсвет, 4-4,5 ч - темнота), после чегоопределяют окислительную активностьсреды по отношению к соответствующимисходным средам, О повышении концентрации металлов в исследуемой воде посравнению с Фоновой судят по статистически достоверному отличию окислительной активности среды в опытныхи контрольных пробах. 9 табл. в течение суток при красном светеинтенсивностью 300-500 лк. Затем среду в опытных пробах заменяют на исследуемую воду и проводят инкубациюкаждого вида по отдельности в течение 28-30 ч при периодическом освещении, 4-4,5 ч - свет интенсивностью6000-8000 лк, 4-4,5 ч - темнота, Вкачестве Физиологической характеристики водорослей, изменяющеися поддействием металлов, измеряют окислительную активность среды. О повышениконцентрации металлов в исследуемойводе по сравнению с Фоновой судят постатистически достоверному отличиюокислительной активности среды вопытных и контрольных вариантах,П р и и е р 1, Водоросли помещаютв чистую морскую воду прп весовомсоотношении биомассы и среды (1:500). -(1:400), Пробы инкубируют в ечениесуток в темноте, при красном светеразличной интенсивности и при обычном искусственном освещении (7000 лк).Затем все пробы водорослей в течениесуток содержат при освещенности7000 лк и после инкубации определяютвеличину окислительной активности(ОЛ) среды.В табл. 1 приведены результатыопределения ОЛ н среде водорослей,адаптированных в темноте, при красномсвете различной интенсивности и приобычном искусственном освещении(7000 лк) в течение 24 ч и затем освещаемых в течение суток (7000 лк),Из табл, 1 видно, что режим проведения адаптации не отражается насреднем уровне окислительной активности среды, но существенно сказывается на вариабельности результатов.Наименьшие величины коэффициента вариации (С) наблюдаются при использовании красного света интенсивностью 300-500 лк.П р и м е р 2. Водоросли инкубируют в морской воде с добавлением солей металлов (концентрация 0,5 мг/лпо металлу) в течение сутбк при различном режиме освещения, Затем биомассу отполаскивают, высушивают, оэоляют в концентрированной азотной кислоте и определяют содержание металлов в тканях растений атомно-абсорбционным методом.В табл. 2 приведены результатыопределения различий в содержаниитяжелых металлов в талдомах водорослей, инкубированных в течение 24 чна среде с фоновым уровнем металлови их повьшенной концентрацией(500 мкг/л) при разном режиме освещения,Как видно из табл. 2, наибольшееувеличение содержания металлов в пробах водорослей наблюдается при чере. -довании 4-часового освещения и 4-часовой темноты,П р и м е р 3. Водоросли ипкубируют в морской воде при периодическомосвещении разной интенсивности,В табл. 3 приведены средние значения ОА среди н норме для 30 видов 5 10 15 20 25 30 35 40 водорослей, инкубиронанных при периодическом освещении (4 ч - свет, 4 ч - темнота) разной интенсивности в течение 28 ч после предварительной адаптации на красном свету.Для всех исследованных водорослей освещенность 7000 лк обеспечивает достаточно высокий уровень ОЛ в норме, необходимый для проведения индикации металлов в среде по изменению ОА. Повышение освещенности сверх этого значения хотя и повышает уровень ОА, но у многих видов водорослей вызывает разрушение пигментного аппарата.П р и м е р 4, Водоросли, очищенные от обрастаний, помещают в сосуды с чистой морской водой при весовом соотношении биомассы и среды 1:500 и инкубируют при красном свете 400 лк в течение 8-48 ч. Затем в сосудах заменяют среду, при этом часть проб заливают вновь чистой водой, а часть - водой с добавлением соли меди (500 мкг/л по металлу) и инкубируютов течение 28 ч при 18-19 С периодическом освещении 7000 лк (4 ч - свет, 4 - темнота), После окончания инкубации определяют окислительную активность как отношение скоростей окисления ДОФА в средах, содержащих водоросли, к скорости окисления ДОФА в соответствующих исходных средах.В табл. 4 приведена окислительная активность среды водорослей с фоновой (фон) и повышенной (изб.) концентрацией меди; средние значения (М) и их среднее квадратическое отклонение (Б) для 5 биологических повторностей в каждом варианте.Как видно из табл, 4, в среде водорослей, адаптировавшихся в течение 8-12 ч, наблюдаются значительные колебания ОА, затрудняющие сопоставление данных в вариантах с различнойконцентрацией меди. Средние значенияОА остаются в целом постоянными, нодля получения статистически достоверных различий между вариантами при малых сроках адаптации необходимоболыное количество повторностей. Разброс данный у водорослей, адаптированных в течение суток, существенно уменьшается и при более длительных сроках адаптации практически не изменяется, Таким образом, оптимальныйсрок адаптации водорослей - 24 ч, более длительная адаптация не отражает514 ся существенно на результатах анализа, но увеличивает общее время его проведения, Использование 24-часовой адаптации водорослей при слабом красном свете позволяет уменьшить число повторностей для каждого варианта до 2 - 3.П р и м е р 5, Биомассу водорослей, подготовленную аналогично опи-+ санному в примере 4 и адаптированную в течение суток при красном свете 400 лк, помещают в среды с фоновым уровнем металлов и в среды с солями меди, цинка или кадмия (200 мкг/л по металлу) и инкубируют при периодическом освещении (4 ч - 7000 лк, 4 ч темнота), Пробы среды отбирают через 12, 20, 28, 36 и 44 ч (нечетное количество чередований световых и темновых периодов, так как отбору проб должен предшествовать световой период) . Определяют ОА в среде водорослей по отношению к соответствующимисходным средам и рассчитывают разность ОА (ОА).В табл. 5 приведена Д ОА (7) при разнь.х сроках инкубации водорослей в морской воде с добавлением солей металлов (200 мкг/л по металлу); среднее (И) и среднее квадратическое отклонение (8) для 5 биологических повторностей. Как видно из табл. 5, в первые 12-20 ч инкубации водорослей на среде с металлами наблюдаются значительные колебания отклика, связанные с неодновременным завершением в. отдельных повторностях первой фазы токсического эффекта - повьшения метаболической активности, приводящего к некоторому увеличению ОА. К 28 ч инкубации токсическое действие данной концентрации металлов на водоросли проявляется в основном в значительном снижении ОА среды, достоверно регистрируемом даже при небольшом количестве повторностей. Продолжение инкубации практически не отражается на качестве получаемых результатов,П р и м е р 6. Разные виды водорослей, предварительно подготовленные аналогично описанному в примере 4, инкубируют в течение 28 ч при периодическом освещении (4 ч - 7000 лк, 4 ч - темнота) на среде с фоновым содержанием металлови средах с добавлением солей меди, цинка, кадмия79876 6 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 свинца и никеля (200 мкг/л по металлу). Определяют ОА по отношению ксоответствующим исходным средам ирассчитывают ДОА.Результаты определения ДОА дляразных видов водорослей после инкубации в течение 28 ч приведены втабл. 6, среднее значение для 5 биологических повторностей.Из табл. 6 видно, что исследованные виды водорослей различаются почувствительности к отдельным металлам. Учитывая, что стандартное отклонение средних значений ХОА, приведенных в таблице, не превышало 25окислительной активности, можно считать, что достоверная индикация концентрации металлов 200 мкг/л достигается при абсолютной величинеОА,превьшающей 100. В табл. 6 представлены значения Д ОЛ, соответствующиеэтому критерию и выделяющие наиболеечувствительные виды водорослей, перспективные для индикации более низких концентраций тяжелых металлов вморской воде,Специфичность чувствительности водорослей к отдельным тяжелым металлам позволяет, используя соответствующие наборы видов, не только констатировать факт повышения концентрации тяжелых металлов в среде, но иидентифицировать конкретные элементы,входящие в комплексное загрязнение.П р и м е р 7, Биомассу каждоговида водорослей, характеризующихсяспецифической чувствительностью к от.дельным металлам или нескольким изних, адаптируют и инкубируют аналогично описанному в примере 6. Испытываемыми образцами служат растворысолей металлов в морской воде (концентрация около 200 мкг/л по каждомуиз металлов).неизвестного состава.В табл. 7 приведены результаты оп-ределения ДОА (среднее для трех биологических повторностей для каждоговида, среднее квадратическое отклонение не превышает 257. окислительнойактивности), В табл. 7 указаны такжеэлементы (на основании данных, частькоторых приведена в примере 6), которые могут в каждом отдельном случаевызывать отклик данного знака и величины (знак "+"), и элементы, наличие повышенных концентраций которыхв образце воды отрицается характеромотклика (знак "-"), 147987 эЛнализируя даннье табл. 7, можно сделать следующие выводы:В образце 1 присутствуют медь и цинк наличие других элементов в по 95 вышенных концентрациях вызывает сомнение, так как не подтверждается реакцией большинства видов.В образце 2 в повышенных концентрациях могут находиться свинец, цинк и кадмийф наличие меди и никеля маловероятно.В образце 3 повышена концентрация кадмия, никеля и цинка и маловероятдо превыПение меди и свинца ыад Фо новым уровнем.В анализируемых образцах воды с помощью атомно-абсорбдддонной спектроФотометрии по стандартной методике определяОт содержале меддцинка кадмия, свинца и икеля.В табл. 8 ьрпведеяы конддентрации тяжелых металло в в и с т д аемых ср едах по даннам атомно в абсорбционно адалддзад среднее для 4 аналитических 25 повторностей, стандартное отклонение не вьппе 5%,Таким образом, втоды о повышении концентрации металлов тз среде, сделанные на основе анализа с применением предложенного способа, совпадают с результатами атомно-абсорбционного анализа проб воды.Таким образом, использование на-35боров различных видов водорослей,обладающих разной чувствительностьюк отдельным металлам, дает возможность не только констатировать фактповышения их концентрации, но и выявить отдел не металлы.П р и м е р 8. Наиболее чувствительные к тяжелым металлам при ихконцентрации 200 мкг/л виды водорослей подготавливают к анализу и инкубируют на средах с металлами аналогично описанному в примере,Используют следующие концентрации металлов, фон, мкг/л: 5, 10, 50,100 После инкубации определяют ОЛсреды водорослей по отошению к соответствующим исходным средам и рассчитывают ЛОА по отношению к ОЛ Фоновой среды.В табл, 9 приведена ЕОЛ среды 55водорослей при различной концентрации металлов; среднее (М) и среднееквадратическое отклонение дБ) для3 биологических повторностей. Как видно иэ табл, 9, субтоксические кОнцентрации металлов (меньше 100 мкг/л) могут вызывать у водорослей увеличение ОА ГЛОЛ положительная, см. также табл. 7), которое достоверно регистрируется и наряду со снижением.ОЛ, наблюдаемым при более высоких концентрациях металлов, может быть показателем реакции водорослей на изменение уровня металлов в среде.Таким образом, предложенный способ позволяет повысить чувствительность и сократить время анализа, уменьшить трудоемкость определения, объемы анализируемых образцов среды при одновременном увеличении количества одновременно испытываемых проб воды,Формула изобретения Способ биоиндикапии тяжелых металлов в морской воде, предусматривающий помещение в камеры с чистой водой и инкубацию тест-объекта - макро- водорослей, адаптацию их к Фоновому содержанию тяжелых металлов, деление камер на две группы - опытные и контрольные, добавление в опытные камеры с макроводорослями исследуемой воды, измерение Физиологической характеристики водорослей, их сравнение и заключение о повышенном содержании тяжелых металлов в исследуемой воде по сравнению с Фоном при статистически достоверном отличии значений физиологической характеристики тестобьекта в опыте по сравнению с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, сокращения времени анализа и увеличения количества одновременно анализируемых проб, адаптацию проводят в течение суток при красном свете интенсивностью 300-500 лк, инкубацию в исследуемой воде проводят по отдельности каждого вида тест- объекта в течение 28-30 ч при периодическом освещении: 4-4,5 ч свет интенсивностью 6000-8000 лк, 4-4,5 ч - темнота, в качестве физиологической характеристики измеряют окислительную активность водорослей, а в качестве тест-объекта используют С 1 айорЬога я 1 дппряопЫ, и/или СЬаегоаогрЬа пдопь 118 ега, и/или ЕпгегошогрЬа ьпгеяггпа 1 ья, и/или Сгаге 1 оддрга дхсЬогоша, и/или Сегашгддтп сх 1 гагддтп, и/или 1,оддгеддяга ЬуЬгЫа и/или СусГояеьга ЬагЬага, при этом для свинца9 14798 тест-объектами являются 11 ча Йепеяггага, и/или Багеаяяцщ ра 111 о 1 цщ, и/или Се 1 Ы 1 цщ 1 аг 1 Го 11 цв, для цинка - Вгуоря 1 я айг 1 аг 1 са, и/или Гга 5 се 1 оцр 1 а гцгцгцгц, и/или ЕпсегощогрЬа рго 11 Гега, для кадмия - ТгсЬосагрця сг.пгця, и/или С 1 асорЬога чаяаЬцпйа, и/или Се 1 Ыыщ сгпа 1 е, и/или Сегащ 1 цщ гцЬгцщ, для никеля - С 1 айо 76 ОрЬога яг 1 щряоп 1, и/или Багяаяяцщ ра 11 Ыцщ, и/или Пхсгуоргегхя йдчап. - сага, и/или Вгуоря 1 я айгаГ 1 са, и/или С 1 айоягерЬця чдгг 1 с 111 асця, для меди - 11 ча Хепеяггага, и/или Сгаге 1 оцра гцгцгцгц, и/или Р 1 сгуога ЙгсЬогоща, и/или Мсгуоргегдя Йчаг 1- сага, и/или Са 11 гащпоп Вгапц 1 агцщ, и/или Ражипа рачоп 1 а.1Таблица 1 Вид водорослей ПокаОА при следующем режиме адаптации затели 7000 лк темнота красный свет, лк Х 1 400 1000 2000 ц 1 ча Репеягга- И га С 703 700299 210,43 0,03458 456161 150,35 0,03 705 71198 1930,14 0,27442 44584 128О, 19 0128 Багяаяяцщра 11 Ыцщ М+. И - среднее и Б - среднее квадратическое отклонение для 1 О биологических повторностей,Т а б л и ц а 2 МеВиды водорослей Разность накопленной и исходной концентраций металлов при следующем режиме освещения, мкг/л талл темнота постоянное чередование света и темноты освещение7000 лк 12:12 4:4 2:2 И+Б М+Б М+Б М+Б М+Б 202 + 23207 + 1810+199 + 1284 + 25245 + 21262 + 12.801199 + 15131 + 18 ЕпгегощогрЬа 1 дпга Багяаяяцщ ра 11 Ыцщ П р и м е ч а н и е, Среднее (М) и среднее квадратическое отклонение (Б) для 8 биологических повторностей. Сц 120 + 2 п 111 + С Е+ з. 60 + РЬ 58 + Сц 192 + 2 п 181 + СЙ 48 + И 1 66 + РЪ 79 + 48 108 + 33 99 + 2 6 + 21 54 + 12. 52 + 12 19013 163 +11 43 + 14 65 + 17 75 + 42 41 1 14 18 11 21 17 15 19 162 + 38 173 + 11 6 + 1 61+ 18 68+ 15 201 + 12 199 + 17 56+ 15 71+ 12 90+ 141479876 Та блица 3 Показатели Окислительная активность (Я) ври освещенности (лк) 500 1000 2000 4000 7000 10000 125 211 253 264 406 521 15 82 124 121 215 312 ИТаблица 4 ОЛ(Е) при длительности адаптации водорослей (ч) Виды водорослей Величина 8 12 24 36 48 Гфон изб. Фон изб,Фон изб. фон. изб, фон изб,328 78 16 14 461 150 321 79 15 13 45 о 153 8 17 14 4 96 3 12 1 108 6 14иды водорослейелилл чина 2 214 1479876 Таблица 6 Виды водорослей ЬОА Металлы Г-150 -359 Таблица 7 Виды водорослей ЬОА, 7 Образец 3 ОА элементы ЬОА элементы ЬОА элемент Багнаяяищ ра 111 ецщ Вкуорятя ас 1 г 1 аг 1 са 341 +Сц 200 +Сц 121 +РЪ,-С386 +2 п,-СцИт108 +Си,+Сд281 +Сц,+СО-224 +Сц,+2 п,+С Б 1 ча Гепеяггага ЕпгегощогрЬа 1 дпга С 1 аоорЬога я 1 щряоп 11 СЬаегощогрЬа щопт 1 тнегаТтсЬосагрия сгтпт.гця КЬос 1 още 1 а 1 агтх Сгаст 1 аг 1 а чеггисояа Сгаге 1 оцрта гцгигцгц Багнаяяитп ра 11 Ыищ Ре 1 егда ттгтфгт От.сгуога т 1 тсЬооща Исгуоргегтя ЙгчагтсагаЕпгегощогрЬа тпгеягтпа 11 яЕпгегощогрЬа рго 1 тГегаБ 1 ча 1 асгцсаВгуорятя айги.аг 1 са С 1 ас 1 орЬога аеаЪцпйа Се 1 Ы 1 ищ 1 агь.Ео 1 дцщ Сгаге 1 оцрга сттсЬогоща Се 1 Ытцщ сг 1 па 1 е Сегаппцщ гцЪгцщ Са 11 тгащтпоп Ргапц 1 агцщСегапйцщ ст.11 агцщ Ьацгепята ЬуЪгЫа Суягояе 1 га ЪагЪага С 1 вдояерЬия чегг 2. - ст.11 агцяРатттпа раопта Сц 2 п РЪ Ит1479876 Продолжение табл,1 ЬОА, Х Образец АОА элементы а ОА элементы ЬОА элементы(онцентрация мкг/ бразе адмий свинец никел мед цинк Исходнаясреда (фон)1 0,51 8,23 0,52 0,56 0,03 0,03 209,13 216,11 3, 11 3, 18 199,683, 12 1,ф 2 1,2 1,2 03,1 206,42 214,35 208,14 3 Таблица Величина лов, мкг/л онцентрация мет 0 50 200 14Виды водорослей Се 1 Ы 1 цщ сгх.па 1 еСегдппцщ гцЬгцщОгсгуорсег.ь с 11 лдг 1 с.Сгдсе 1 оцргд с 1 гсЬогоща С 1 дс 1 оясерЬця чег 1 с 11,Рас 1.пд рачоп 1 д111 ча ГепеясгагаСгдс 1.аг 1.д ,"еп цсоядЕп 1:егощогрЬд 1 пеяс. Виды водорослей . Металл Багяаяяцп ра 11. -с 1 цщСпдеСощогрЬа щоп.11 яегаСЬаеТощогрйапюп 11 ЦегаС 1 аегощогрЬадопг 1 г 8 егдБдгяаяяцщ ра 111 с 1 цщСйаесощогрЬащоп 1118 егаСЬаесощогрЬдщоп 111 с; е гд. М +100