Способ приготовления основы для микробиологических питательных сред

(51) 4 С 12 М 1/20, 1/00// С 12 И 120 С 12 К ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ аэания по испольрок годности кронструированияпитательных сред. микробиологическихМ., 1980. детельство СССР 12 И 1/00, 1977. Авторское742463, кл(57) Изобретени биологической и относится к микр омышленности, а имен питательных сред и чения, С целью увелино к основам дл способам их пол ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ ТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологииим, Пастера(56) Методические укзованию утративших свезаменителей для ко 54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ОСНОВЫ ДЛЯМИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЪХ СРЕД чения выхода целевого продукта, улучшения физических и ростовых свойствпитательных сред в качестве основь 1используют биомассу слизистых бацилл,которую сначала подвергают гидролизув растворе соляной кислоты при рН0,45-0,65: 120-123 С в течение 3040 мин, а затем полученный последекантации прозрачной фазы осадокподвергают ферментативному гидролизуподжелудочной железой при рН 7,8-8,0;40-42 С в течение 10- 14 дней. Прозрачные фракции ферментативного икислотного гидролизатов смешивают всоотношении 1:1,17-1:1,3 и выдерживают при 5-7 С в течение 4-5 дней,Полученная основа имеет необходимоесодержание общего и аминного азота1000-1100 и 393-470 мг соответственно, полностью удовлетворяет потребность в углероде, который содержится ваминокислотах(всего 17 аминокислот изних 10 незаменимых) и полисахаридах ине требует добавления ростовыхфакторов, так как содержит витамины группы Ви А и микроэлементы. 3 табл.1280002 б2,08 Темно-коркч- невык гидролизатаАмкноаэот, мг%Общий азот, мг%Степень расщепле -ния, % 130,0 б 90,0 19,8 1Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именнок основам для питательных сред и способам кх получения.Целью изобретения является уве,пк 5чение выхода целевого продукта, улучшение Физических и ростовых свойствпитательных сред, приготовленных напредлагаемой основе.Способ заключается в том, что для 10приготовления основы питательных средиспользуют биомассу слизистых бацилл,которые подвергаются комбинированному способу гидролиза, включающемудве стадии: 15кислотный гидролиз, который разлагает белок слизистых бацилл на 20-30%с получением прозрачного гидролизата;Ферментативный гидролиз как более мягкий и щадящий, который дорасщепляет остатки биомассы на 55-б 0%.Предварительный кислотный гидролкз необходим потому, что биомассаслизистых бацилл не может разложиться до нужной степени под действием фермента, ввиду чего получаемый продуктгидролиза (основа для питательнойсреды) очень мутен и не пригоден дляконструирования питательных сред. Деструкция белка бацилл происходиттолько под действием кислот, в результате чего получается прозрачныйгидролиэат.Наилучшими условиями получения кислотного гидролиэата биомассы сли зистых бацилл, используемого в качестве основы для питательных сред, являются: рН среды, в которой приводится гидролиэ, 0,45-0,65; с 120- 123 С; время 40-бО мин. 40Если при кислотном гидролизе рН среды брать выше 0,45 (0,2-0,3), то ведение гидролиза при такой же температуре (120-123 С) обеспечит необходимую степень расщепления.(20-30%) 45 за более короткое время (25-35 мин), но гидролизат будет содержать большое количество хлоридов и, как следствие этого, питательные среды, при-. готовленные на его основе, будут так Жесодержать избыточное количество МаС 1, количественное содержание которого в питательных средах строго лимитировано. Кроме того, произойдет деструкция многих выделившихся амина кислот (тирозина, серина, аланина и др,), необходимых для роста микроорганизмов. П р и м е р 1, Исходные данные: рН среды 0,2; продолжительнос:ь гкдролкэа 25 мкн; темпера.ура гкдролкза 123 С,100,0 г сухой биомассы заливают 4,0 л воды, добавляют 300,0 мл концентрирсванной соляной кислоты, гкдролкэ сырья проводят прк с 123 С в течение 25 мкн. Содержанке амкноазота в смеси до гкдрслкза 100,48 мг%.Химические показатели кислотного гкдролизата:Амкноаэот, мг% 262,38Общий азот, мг% 1020, 0Степень расщеплс -ния, %Хлоркды, %Цвет Содержание амкнсаэота увеличивается в 2,б раза,Данный пример подтверждает получе.ние кислотного гкдролкэата с необходимой степенью расшеппенкя, но он содержит завьшенное количество хлоридов к имеет плохие Фкэкческке свойства - темный цвет, поэтому недопустимо его применение в качестве основы для питательных сред.Если же кислотный гкдроллз проводить при рН ниже О,б 5 (0,75-1,0), то ведение гидролиза при той же температуре (120-123 фС) обеспечит необходимую степень расщеплснкя (20 - 30%) за более длительный период времени (более 2 ч). За этот период времени произойдет так же .деструкция многкхС. аминоккспот, необхоцкмых для роста и размножения микроорганизмов. Кроме того, гицролкэат буцет кметь плохие Фиэическле свойства (темно-коричневый цвет).П р и м е р 2. Исходные данные: рН среды 1,0; продопжктельность гидролиза 2 ч 10 мкн, г 120 С.100,0 г сухой биомассы запквают 4,0 л воды, добавляют 1 б 5 мл концентрированной соляной кислоты, гкдролкз сырья прэводят прк с 120 С в течение 2 ч 10 млн. Содержание амкнаазота в смеси до гкдролкэа 92,4 мг%.Химические показатели кислотногоХлориды, 7. 0,704Цвет Темно-коричневыйДанный пример подтверждает получение кислотного гидролизата с необходимой степенью расщепления, Но времягидролиза увеличивается и, какследствие этого, ухудшаются физические свойства гидролизата (темно-коричневь 1 Й цвет), что затрудняет егоприменение как основы для питательных сред,При еще более низком рН (ниже 2,0)и температуре 120-123 С достигаетсярасщепление биомассы за еще болеедлительный период времени (более 6 ч),15и продукт гидролиза будет иметь плохие физические свойства (темный цвет).При ведении кислотного гидролизабиомассы при рН 0,45-0,65 в течение30 мин и менее получается кислотный 20гидролизат с плохими физическими свойствами и с малой степенью расщепления(до 87.), что приведет к удлинениюстадии ферментативного гидролиза(до 4 недель), 25Если же проводить гидролизпри рН 0,45-0,65 в течение ЭОминпри пониженной температуре (60-80 С),то, как и в вышеприведенном примере,получается кислотный гидролизат с еще 30более малой степенью расщепления(до 3-47) и плохими физическими свойствами (мутный). Гидролиз биомассысоляной кислотой при рН 0,45-0,65,при 120- 123 С в течение 40-60 мин 35деструктирует белок биомассы на 20307, в результате чего продукты гидролиза содержат; смесь разнообразныхчастиц распада белка и некоторые необходимые для роста микробов аминокислоты, не подвергшиеся деструкции;минимальное количество хлоридов,которые оказывают отрицательное влияние на ростовые свойства питательных сред; и имеют хорошие физические 45свойства (по прозрачности и цвету),что позволяет использовать как составную часть основы для питательныхсред.Самостоятельного применения кислотный гидрализат иметь не может,так как имеет малую степень расщепления, недостаточную для примененияего в качестве основы для питательных сред. 55П р и м е р 3, Исходные данные: рНсреды 0,45; продолжительность гидролиза 40 мин при 120 С,100,0 г сухой биомассы заливают 4,0 л воды, добавляют 260,0 мл концентрированной соляной кислоты гидролизоФ проводят при 120 С в течение 40 мин. Содержание аминоазота в смеси до гидролиза 78,6 мг.Химические показатели кислотного гидролизата:Аминоазот, мг% 151,2Общий азот, мг 7. 750,0Хлориды, 7 1, 281Степень расщепления, 7 м,20Цвет Слабо-коричневыйСодержание аминного азота увеличилось почти вдвое,Получено 3,0 л прозрачного кислотного гидролизата, который декантируют и 1,2 л осадка.Данный пример подтверждает получение кислотного гидролизата с необходимыми химическими показателями и хорошими физическими свойствами, что позволяет испольэовать его как составную часть основы для питательных сред.П р и м е р 4. Исходные данные: рН среды 0,65; продолжительность гидро- лиза 60 мин при 123 С.100,0 г сухой биомассы заливают 4,0 л воды, добавляют 220,0 мл концентрированной соляной кислоты, гидролиз сырья проводят при 123 С в течение 60 мин.Содержание аминоазота в смеси до гидролиза 128,8 мг 7Химические показатели кислотногогидролизата:Лминоазот, мг% 240,55Общий азот, мг% 750,0Хлориды, % О, 980Степень расщепления, % ЯЗОЦвет Слабо-коричневыйПолучено 3,2 л прозрачного кислотного гидролизата, который декантируют, и 1, 0 л осадка.Данный пример подтверждает получение кислотного гидролизата с необходимыми химическими показателями и хорошими физическими свойствами, что позволяет использовать его как составную часть основы для питательных сред,В случае проведения только кислотного гидролиза с применением соляной кислоты для получения гидролизата с необходимой степенью расщеп 128000ления, применяемого в качестве основы для питательных сред, необходимоподействовать на биомассу слизистыхбацилл очень крепкой соляной кислотой при рН среды О, 1-0, 15, продслжительнасти более 4,5 ч и 110-120 С.Как следствие этого, продукты гидролиза будут иметь плохие Физическиесвойства (темно-коричневьй), произойдет деструкция многих аминокислот,необходимых для роста микроорганизмов (триптофан, тирозин, алании, серии, метионин и др,), кроме тогс,продукты гидролиза будут содержатьбольшое количество кислоты которуюнеобходимо удалить или нейтрализовать. При нейтрализации произойдетобразование большого количества хлоридов, т.е, основа будет иметь боль"шую зольность, что недопустимо иметьв основе питательных сре,ц,установлено, что хорошие ростовыесвойства питательных сред, приготовленных на основе из гидролизатов биомассы, будут в этом случае, если Основа будет иметь степень расщеплениябелков 40-45%. Поэтому для достижения этого и для увеличения выхода це-.левого продукта с единицы биомассыосадок после кислотного гидролизя дополнительно подвергают Ферментативно-.му гидролизу, как более мягкому и щадящему, который проводят с приме.ением поджелудочной железы в течение 1014 сут, так как в дальнейшем нарастает аминоазот в гидролизате крайне незначительно.Для этого кислотные осадки заливают водой, доводят рН смеси до ,8- 8,0, добавлением 20% МаОН. Фарша поджелудочной железы берут из расчета 100 г на 1 л жидкости, консервируют хлороформом в количестве 1-1,3% эт объема жидкости и термостятируют при 40-42 С. Длительность Ферментатизнаго гидролиза 10" 14 дн обеспечива.т необходимое накопление в гидролизате и нужную степень расщепления сыр:.я равную 55-60%. При меньшем времени воздействия поджелудочной железы (5- У дн) на кислотный остаток биома 5 сы степень расщепления последнего уменьшается (30-33%) и в гидролизате будут преобладать в основном высокомолекулярные пептиды и пептоны. Аналогична величина рН среды устанавливает ся таким образом, чтобы это обеспечивало максимальную активность применяемого Фермента. Оптимальная реакцияу ного гидролизятя;1 МЕ 1-ОЯЗОГ 16 Общй азот. мг% Степень ряс е 11.1:ения, % 638,42500 среды, которая Обеспечивает максимальную активность под;келудочной железы нри заданной температуре 40-42 С, находится в пределах ,8-8,0 рН, Отрегулировать рН среды до требуемьвс прделов в процессе гидролиза можно добавлением раствора шелочи или кисЛО ТЬ 1,Для хорашега роста большинства мик роорганзмов необходима, чтобы в питательных средах содержалось определенное коничественное и зидовое содержание свободных аминокислот, которыебудут Освобождаться ГО мере воздейст 15 вия поджелудочной железь: на. кислотный Осгяток биомассы.П р и ". е р 5. Исходные данные; рНосреды 8,0,. температура гидролиза 42 С,.:1 ЕМ; - : 15 рО.ПИЗя 1 3 дп,20 Кислотнь 1 й Осяцэк в количестве 1,0 лзализаот 2,5 л вслы, добавляют 350,0 гФарша лоджелудочнэй железы, доводят20%-ным растзаром МаОН до рН 8, 0; кон,сервруют хларофоэмом. добавляя егоВ кали,естве 1% О: сбье 11 я смеси Гид; -оролизуют нри 42 С в Гечение 10 дн втермос Гате,Содержание ямк оязата в смеси цогермостатиравяния 128,8 мг%.30 Химические пок,зятели ферментятив -НОГО Г 11 ДРОЛ 1 ЗЯТЯ:ЛМ:НОЯЗОТ, Мг. 644,42 ООГ 1 ИЙ ЯЗО Г 5 М: Ь 150Степень расщеде:И 515 %Получено 3,3 л 1 розрячного ферментятивнога гдрал.1 ята с необходимой ,.тчя основь пи гательць 1 к сред степенью Рясщеплени 5 в минмял,но короткий40 суок,П р .-; м " р 6, Исхацныс цанные;рН среды .,8, теь;: в .ерятура гидрализа4 О С нрем 51 ги Цра;1 и 314 дн,Кс;О Гный гидрал:1 зят в колн 11 естве45 1,0 л заливаот 2,О л воды, добявляот 350:,О г фярпа поджелудочной жецазы 5 дабявляют 20% раствор; БяОН до рН УрЗрка 51 сернирун 1 т хлараоорам в количестве 1% с 5 бъемя жидк 15 с -и, гидролиз Вео .,50 цут при 40 " в теен.;е 14 цн в термостате.Содержание ами 1:.Оазотя в смеси дагермас яг 1 лравяния бц -; мг80007 Смесь ферментативного и кислотно 30 го гидролизатов хранится при той жетемпературе до одного года. Добавкаконсерванта и его количество такиеже, что у ферментативного гидролизата.П р и м е р 7. Из данной основыготовили питательные среды для контроля стерильности и плотные питательные среды. Причем чувствительность сред, приготовленных на этой40 основе по сравнению с питательнымисредами, приготовленными на основеказеина, одинакова, а в некоторых случаях превосходит при значительно меньшем содержании аминоазота,т.е. расход основы на 1 л питатель"ных сред, приготовленных из гидролизата Вас 111 из шцс 1 аяепозцз, меньше. Расходагидролизата каэеина.Сравнительные ростовые свойства 50 пРедставлены в табл. 1. 7 12Получено 3,2 л прозрачного ферментативного гидролизата с необходимой для основы питательных сред степенью расщепления в максимально короткий срок.Для хорошего роста большинствамикробов необходимо, чтобы в питательной среде в среднем количествоаминоазота было в пределах 25-307от общего азота.Смешивание ферментативного и кислотного гидролизатов в соотношении1:1, 17-1:1,3 позволяет получить основу с необходимой степенью расщепления (40-457) и, какследствие, изтакой основы можно приготовить питательные среды с необходимым содержанием аминного и общего азота (содержание аминоазота 395-4707., а общегобелка 100-1100 мг 7),С повышением ферментативного гид ролизата в этом объеме смеси увеличивается степень расщепления основы(до 557), но ростовые свойства основы от этого не улучшаются. Следовательно, увеличение ферментативногогидролизата нерационально и экономически не выгодно, так как себестоимость его гораздо выше кислотногогидролизата ввиду длительности процесса первого и, следовательно, требует больших энергозатрат.С понижением содержания ферментативного гидролизата уменьшается степень расщепления основы (до 307) и,как следствие, ростовые свойства питательных сред резко ухудшаются.С повышением содержания кислотногогидролизата в этом объеме смеси степень расщепления основы незначительно повышается (до 48 Х), но одновременно происходит и повышение содержания КаС 1 (1,0-1,3), что недопустимо,С понижением содержания кислотногогидролизата в смеси степень расщепления основы повышается (до 507), со-держание НаС 1 в ней уменьшается, норостовые свойства питательных сред,приготовленных из этой основы, неулучшаются, следовательно, уменьшение нерационально и экономически невыгодно, так как это должно привести к увеличению расхода ферментативного гидролизата, более дорогостоя 5 щего р чем кислотныйВыбранные оптимальные соотношения прозрачных фракций ферментативного и кислотного гидролизатов биомассы слизистых бацилл способствуют10 достижению цели изобретения,Смесь выдерживают при 5-7 С 4-5 дней для выпадения нерасщепленныхбелков ферментативного гидролизата,инактивации ферментов, установления15 стабильности РН и содержания аминного азота, За этот срок происходятаналогичные процессы.,Фракции могут храниться длительное время в холодильной камере или20 бытовом холодильнике. Кислотнаяфракция, имеющая РН 0,45-0,65, хранится до 2-х лет при 5-8 С,ферментативная фракция хранится при этой же температуре до одного года, Консерван 25 том для нее является хлороформ,который добавляется согласно литературным данным из расчета О, 17.2,1 Аспарагиновая 3,2 Глютаминовая 9,1 микроорганизмы входят и в список последних методических рекомендаций. 15Та блица 2 Алании 3,2 Глицин Микроорганизмы Агаровые среды 4,4 16,3 Лизин а основе на основ гидролизата био гиии гидролизатакилвкиа,ссь О-б исти ь 8 Орнит реони 0 10-7 со 11. 01 Амин омасл Сарйу 1 оацгецз 10 0 и культ ен ро имальные разведениз которых был пблобов;еры колоний нескпо сравнению сиными средами.м е р 9, Проводиларактеристика химииомассы слизистых а Хетионин ры, мик раз 4 Гистидин Количество амиолько крупдругими исн пы ь сравн П р ильная хстава б уриновые иимидиновыеоСновы м ческого бацилл рожжеи.Резул табл.3. едставлен Т а бт Количествороэлементо Ц 7 5 С е 5-403 лисахаридовНаличие вита в группы Аминокислоть Лей цин16,3 Наличиевитмина А Фенилаланин 3,6 11 1280007П р и м е р 8. Сравнительная характеристика ростовых свойств плотны питательных сред, приготовленных на основе гидролизата биомассы слизистых бацилл и на основе гидролизата киль 5 ки Дагестанского института питательных сред представлена в табл, 2.Были взяты наиболее распространенные виды патогенных микроорганизмов кишечной и гноеродной группы, кото О рые имеют первостепенное значение в медицинской практике для диагности ки вызываемых ими заболеваний. Эти2 Й)00 у Форму а РЕД аК тгОР, Д О-,"." -Заказ 7020/23 Преимуществом прс,соба получения Ос новы :. г:бацилл являе 1 с ва,: -го дефицитного пишево"О,.;р .иса и цр, (казеинз ходимости введения в: ггъ-"щие полученну 1 о Основ; ст:11 ул; - : - :;:г;:роста так как она -.:",пе 1.,".:;., е;ОбХОдИМЫЕ КОМПОН НтЫ,ЛП ;:Оа;:И 11 г,"НИЯ И ВЬЩЕЛЕНИЯ 1 гИКРС-, -:кг сырья 1 биомаг ги спи-: - ,: .; г:ЦИЛЛу Можио Ппг 1 ГО. ОТ 1 СЮза больше питате.-1-1,:,.и той же концентог -ета 120 мг 7.у че 1 ино:вы, полученной, з ,;з - .гидролизатов дро 1,",жег СпОсОб приготов,.1 е;:.и,"Омикробиологических Произвоцственно-;.Они.г 1 ь 1,1 и,рерм".н гатнвныи ;11,.р,.з:11 1:;сход:.Ой биомассы микроорган. з".1 О: поджелудочной железой. о та сеощийся тем,что,с О Н т,п с 1: - ;ИЧЕННЯ ВЫХОДа ЦЕЛЕВОГО ПРО ,;та,; улучше:.:ия физических и росто- Н 1 х свойств питательных сред, в качестна 1 сход 11 О 1: Оиомассы используют с тнзнст:; - ба илль 1 которые предваэи- ГЕУ,.ЬНО Пог 1 ВЕ РГах 1 т: ИДРОЛИЗУ В РаСтВОсс)янгт к 1( рты при рП 0,45 О,б 5оте:.и е;:. т у:е 12 0-25 Г в те - ениеу 1 .,и 1 затем -,е (анимации.Н 7.0-3.0 в течение От 10з дачные фракции фермен 1:Иг.,:.О .О-О ГИДРОЛИЗатОВ