Способ определения триазиновых гербицидов

(5)5 0 01 ЗС)БР Т 2 дов. Наряду с атрадругие гербициды, и присутствие которых вых и поверхностны ном применяются иоизводные триазина,бнаружено в грунтоодах. чеРУ,5 Ш Г СУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР( 1) Др, Пфайффер Биоаналютик КГ(ОЕ) (7 ) Вольфганг Пфайффер, Рудольф Х, Дитте ь и-Вол ьфган г Мис (О Е) (5 )Заявка ЕРА 20180305, кл, С 07 О 251/50, 1984. (5 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИАЗИНОВ Х,ГЕРБИЦИДОВ (5 ) Использование: определение веществ в ок ужающей среде. Сущность изобретения: дл определения триазиновых гербицидов проводят иммунологическую реакцию, испо)ьзуя антитела, полученные иммунизаИзобретение относится к иммунологи- кому способу определения веществ в окающей среде, в частности средств для иты растений в питьевой или грунтовых ах. Атразин представляет собой белый поок без запаха. Химическое название его ор-зтиламино-изоп ропиламино,3, риазин. В течение вот уже 30 лет он око используется в качестве гербицида, анизм действия его заключается в полении фотосинтеза, в результате чего рняки" быстро .засыхают, Атразин исьзуется, в частности, для уничтожения няков на кукурузных полях. Так, в ФРГвсех площадей, занятых под кукурузу, абатывается атразином, который, таким азом, при годовом расходе 1000 т занит первое место среди других гербициЦ. 1838787 АЗ 53, С 07 О 213/00,251/5 О циеи животных конъюгатами соединенйформулы:йМ в которои означают В 1-группу Нй(СпН 2 п+1), где и - число от 0 до 8. ЩСпН 2 п+1) где т - число от 1 до 8 галоген или группа ОН, В 2 - группу НКСрН 2 р+1, где ц - число от 0 до 8, И(СВН 2 в+1)2. где В - число от 1 до 8 или галоген, Вз - галоген, ЯСПН 2 П+1, где и - число от 0 до 8, аминогруппу или НИСпН 2 ПСООН, где т - число от 1 до 8, причем коньюгирование производят через заместители В 1,В 2 или Вз. Иммунологическую реакцию триэзиновых гербицидов осуществляют одновременно или последовательно по меньшей мере с двумя энтителами. 2 табл. Долгое время считалось, что производные триазина после обработки ими растений постепенно разлагаются и связываются с частицами почвы, и загрязнение ими грунтовых вод, таким образом, исключено. На практике однако оказалось, что эти соединения являются стабильными; время, за которое в почве распадается половина активного вещества, составляет 2-5 месяцев. Из песчаных, а также глинистых и суглинистых почв активное вещество довольно легко вымывается грунтовыми водами. в результате чего остатки триазина могут обнаруживаться в грунтовых водах и черезнесколько лет. При этом для отдельных веществ верхний предел составляет 0,0001 мг/л (100 нг/л), а суммарное содержаниеэтих веществ не должно превышать 0,0005 мг/л (500 нг/л),Для точного аналитического определения чувствительность анализа должна быть до двух порядков ниже этого значения. Иэзэ большого количества веществ, которые нужно определять, и низких предельныхконцентраций возникает однако серьезная 510 проблема определения их химическими методами. Физико-химические методы анализа (газовая хроматография,. сочетаниегэзовой громатографии и масс-спектрометрии, высокопроизводительная жидкостнаяхрог этогрэфия) для идентификации и количественного определения химических веществ требуют трудоемких методовконцентрирования. Кроме того, они очень 20дороги и трудоемки. К тому же эти методыне дают возможности судить о токсичностиэнализирув ых соединений,Современные биохимические методыанализа представляют собой иммунологические тесты (так называемый "иммуно-анализ"), в которых в качестве испытуемыхсоединений используются части клеток. Иммунологические методы анализа для анализа вод являются высокочувствительными и З 0наиболее быстрыми и дают возможностьбыстоо, эффективно и с сравнительно небольшими затратами осуществлять мониторинг акружэюгцей среды.Иммунотесты представляют собой вы- З 5сокочувствительные системы для количественного определения веществ, основанныена реакции антиген-антитело, Для осуществления иммуноанализа вначале индуцируют антитела путем иммунизации 40лабораторных животных и затем получаютих из сыворотки этих животных или продуцирующих их лимфоцитов, Очистку антителосуществляют нэ колоннах для аффиннойхроматографии, содержащих в качестве материала-наполнителя, например агарозу.Антитела представляют собой одну из природных защитных систем высших животныхорганизмов, Защитная функция основананэ том, что при прививке естественной или 50искусственной инфекции индуцируютсяспецифические антитела. Предпосылкой образования антител является определеннаявеличина молекул. Для индуцирования образования специфических антител по отношению к очень маленьким молекулам,например средствам для защиты растений,их гаптены перед иммунизацией необходимо закрепить на молекуле-носителе с высоклм молекулярным весом, например белке(гемоцианин, альбумин бычьей сыворотки, альбумин яйца, тироглобулин, полилиэин и др.).Для определения химического вещества используют только такую связь антигенантитело, которая возникает при добавлении к антителу пробы, содержащей химическое вещество, являющееся антигеном. В классическом иммуноанализе определяемые антигены конкурируют с аналогичными по специфичности антигенами, меченными радиоактивной меткой, за места связи на антителе, В последнее время наряду с радиоиммунным анализом (РИА) большое значение приобрел ферментный иммунный анализ(ФИА), в котором антиген с радиоактивной меткой заменяется коньюгатом фермент-антиген, который затем может конкурировать за свободные места связи на антителе с антигенами пробы, При таком конкурирующем ФИА происходит конкуренция между определенным количеством меченного ферментом антигена.и антигеном пробы за места связи на антителе, которые в свою очередь.за счет адсорбционных или ковалентных сил связаны с поверхностью носителя, например поверхностью полистирола, При небольшой концентрации антигенов в пробе с антителом связывается большое количество ферментной метки (высокая степень расхода субстрата) и, наоборот, при высокой концентрации антигенов в пробе с антителом связывается лишь небольшое количество ферментной метки (низкая степень расхода субстрата). Ингибирование связи ферментной метки является, таким образом, функцией концентрации антигенов в пробе. После отделения несвязанной ферментной метки путем отмывки можно по степени расхода субстрата определить долю связанного меченного ферментом антигенэ и тем самым концентрацию антигена в пробе, Мерой количества связанной ферментной метки является абсорбция прореагировавшего субстрата. С помощью вышеописанной техники индуцируют специфические по отношению к различным пестицидам антитела, а иммуноанализ, являясь быстрым, высокоселективным и тем самым сравнительно недорогим методом анализа, дает решение проблемы определения этих веществ. Нередки однако случаи, когда однозначная идентификация и количественное определение на основе перекрестных реакций с помощью такого иммуноанализа невозможны, Под перекрестной реакцией имеется в виду явление, заключающееся в том, что антитела "распознают" одинаковые функциональные группы в молекулах различного строения, 1838787от 0 до 8, ИСНър 1 причем и означает целое число от 1 до 8, НИ-С,Н 2,У, причем У означает циано-, амино- или СООН-группу, а Ь целое число от 1 до 8, СхР 2 х 2, причем 7 означает циано-, амино- или СООН-группу, а Х целое число от 1 до 8, азид. атом галогена, 5 Н-группу, ОН-группу или группу НИСбН 4 С 1;В 2 - группу НЙСяН 2 я+1, причем р означает 0 целое число от 0 до 8, М(СН 2 г+1)2, причем гозначает целое число от 1 до 8, Нй-СяН 2 я, причем У означает циано-, амина-, азидоили СООН-группу, а с 1 целое число от 1 до 8, М-СгН 2 г+1 2, причем Л означает цианоами но-, азидо- или СООН-группу или группуСН 2 я, а г и 1 целое число от 1 до 8, азид, атом галогена, ЯН-группу или ОН-группу; Вз - атом галогена. ЯС,Н 2,+, причем и означает целое число от 0 до 8, ОС,Н 2+1, при чем п означает целое число от 0 до 8,циано-арбоксильную, амино- или СНО- группу, причем заместитель Вз может находиться в мета-положении относительно В 1 и В 2 или в орто- или пара-положении относительно В иВ 2, отличающийся тем, что закреплением указанного соединения (1) (антигена) на матрице через заместители В, В 2 или Вз экспонируется только часть его молекулы: иммунизацией подопытных животных получают антитела А, В, или С, предпочтительно реагирующие на эту экспонированную часть молекулы соединения (1), и для иммунологического определения соединения (1) предположительно содержащую его пробу в сериях опытов одновременно или в различной последовательности подвергают взаимодействию с по меньшей мере двумя из вышеуказанных антител А, В, или С и на основании образования в сериях опытов связи антиген-антитело проводят количественное и качественное определение соединения (1). По предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения соединение формулы (1) представляет мета-замещенное шестизвенное ароматическое кольцо, содержащее до трех атомов азота, Наиболее предпочтительными при этом являются производные пиридина, пиримидина или триазина.По предпочтительному варианту осуществления предлагаемого способа для иммунологического определения три антитела А, В и С используются в сериях опытов в следующей последовательности: первая серия: АВС; вторая последовательность: ВСА; третья последовательность: САВ;При этом пробу с определяемым веществом по отдельности подвергают взаимодействию с каждым из указанных антител, Для этой цели исследуемые растворы можХ, оХ ХО, Кк Йй 50 55в которойзХ, Х, Х означают атом углерода илиамлота4 6Х, Х, Х . атом углерода; В- группуН (СпН 2 п+1), причем и означает целое число руппируя эти различные молекулы по принипу одинакового воздействия, При этом днако нельзя сделать различия между отельными молекулами. Особенно ярко этот ффект проя.вляется в случае небольших мо екул (антигенов), так как они должны быть вязаны с матрицей (белком), и поэтому познавательным регионом является не вся олекула, а лишь ее отвращенная от матрицы сторона. В результате молекулы с одина овой структурой у этой отвращенной тороны часто становятся неразличимыми с омощью иммуноанализа. С другой стороны, во многих случаях перекрестная реакия является как раз желательной, так как с 1 е помощью можно определять не только нтигены, используемые специально для олучения антитела, но и соединения аналогичного химического строения или с такой е биологической активностью, как и ис ользуемый антиген, Целенаправленно рименяя перекрестные реакции, в ходе одого теста можно определять различные, но тносящиеся по воздействию к одному к 1 ассу вещества. Это особенно ценно при 25 еобходимости оценки токсичности еще незученных соединений. Благодаря этому ажно свести к минимуму опыта на живот ых и биологические тесты, так с помощью вышеописанного принципа разделения на 30 к ассы по действию становится возможным сделать предварительную оценку экотоксикрлогической опасности еще неисследованных соединений.Задачей настоящего изобретения явля естся разработка иммунологического способа определения, с помощью которого м 1 ожно было бы определять триазиновые грбициды и соединения с аналогичным хи-мическим строением или одинаковой биоло гической активностью, относящиеся по д;йствию к одному классу, и который бы в т же время позволял однозначно идентиф цировать отдельные химические соедин ния в сложных смесях, 45Решением указанной задачи является и 4 мунологический способ определения соединений формулызвестными способами, в частности с поощью аффинной хроматографии, с испольованием заместителей в соответствии с ормулой (1).Полученные антитела абсорбируют наоверхности полистирола полостей пластин ля микротитрования. Для этого растворят антитела в карбонатном буфере а 2 СОз/йаНСОз 50 ммоль/л; рН 9,6), доавляют в полости пластины для микротитования пипеткой по 0,25 мл полученного аствора, оставляют пластины на ночь при омнатной температуре и на следующий ень промывают их ТВЯ-буфером. Хорошо одготовленные пластины хранят сухими ри -20 С. Для анализа в полости вносят 80 чл пробы исследуемого водного раствоа (концентрация определяемого веществат 1 мкг/л до 200 мг/л) и добавляют по 50кл ферментной метки, представляющей обой конъюгат щелочной фосфатазы и тризина, природа которого определяется в заисимости от выбранного антитела. Если нализ проводят с антителом А, то с Ферентом связывают аметрин. При работе же антителом В или С применяют соответстенно симазин или пропазин.Резким встряхиванием микротитроальной пластины в горизонтальной плоскоти смешивают растворы. После инкубэции течение еще часа при 20 ОС удаляют путем отмывки ТВЯ.буфером (ВО ммол/л трио/ок.иметил/-аминометана, 1 ммолл М 9 С 12, 50 молл йаС 1, рН 7,8 за счет НС 1, 0,05 / полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат) все не связанные с антителом молекулы. Для колиественного определения связанного меенного фермента в полости добавляют по 125 мкл раствора субстрата фосфатазы (1 мг и-нитрофенилфосфата на мл крабонатного буфера). Ферментная реакция протекает при 20 С. Ее однако можно ускорить инкубацией при повышенной температуре. Поглощение раствора в полостях определяют ,с помощью фотометра с вертикальным пучком света, при длине волны 405 км.Для того, чтобы повысить чувствительность, рекомендуется оставлять пластины 1 на ночь при 4 С. При этом однако следует 1 считаться с тем, что если не предъявлять специальных требований к чистоте реактивов, приборов и помещения, то невозможно добиться воспроизводимых результатов при концентрациях порядка м,т,Расчет концентрации антигена в пробе ,производят исходя из следующих сообра 1 жений. Меченный Ферментом антиген свя 1 зывается прежде всего с теми местами 1 антитела, которые остаются свободными ,после инкубации его с антигеном пробы.5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 активными различные антитела, находятся в различных молекулах. Если же по меньшей мередве экспонированные части находятся в одной молекуле, то наблюдается разброс, Это объясняется тем, что молекула, содержащая две такие зкспонированные части,Так, при высокой концентрации анигенов пробы связывается лишь небольшое количество ферментной метки, Гри низкой же концентрации антигенов пробы, наоборот, связывается большое количество ферментной метки. Количество связанной ферментной метки является, таким образом, функцией концентрации антигена в пробе. Мерой количества связанной ферментной метки служит величина абсорбции прореагировавшего субстрата (цветная реакция с переходом от бесцветного к желтому цвету),Расчет, Отношение абсорбции определяемой (А=Ая-Ат) и нулевой проб (ВО=АБО в А)В / В О=-(АЕ - АокБ):(Абуо - Ао),где В/ВО - отношение количества связанной ферментной метки в присутствии антигена (В) к количеству связанной Ферментной метки в отсутствии антигена (ВО); Аво - абсорбция (при 405 нм) в качестве меры количества связанной ферментной метки в отсутствии антигена (ВО):Ав - абсорбция (при 405 нм) в качестве меры количества связанной ферментной метки в присутствии неизвестной концентрации антигена (гербицида) в пробе;Аов - абсорбция (при 405 нм) в качестве меры количества связанной ферментной метки в отсутствии париетальных антител.Если нанести значения В/ВО по оси иуи относительно логарифма концентрации гербицида, то получается сигмоидная кривая, Для спрямления кривой для большего удобства работы предложено по оси иум также откладывать логарифмические значения (логарифмические координаты). Для оценки однако оказалось целесообразнее выражать степень торможения (1 - В/ВО) через интеграл нормального распределения, На практике для этой цели вместо частоты на вероятностную бумагу наносят процентное торможение (100/1 - В/ВО), В результате происходит спрямление сигмоидной кривой.Для определения антигена в пробе в отдельных опытах исследуемую пробу обрабатывают по отдельности или в определенной последовательности каждым из используемых энтигенов. В случае послед- нега способа оказалось, что в кэждг,й серии опытов одна и та же степень ингибирования наблюдается, когда экспонированные части молекул, по отношению к которым являютсявследствие связывания с антителом как за счет одной, так и за счет другой части, удаляется из раствора и поэтому после переноса рзствора в следующую полость она уже не может принять участия в связывании. Если рассмотреть все другие возможности связывания, то можно получить следующую матрицу ингибирования (табл. 1), из которой вытекают основные структуры. Приведенную матрицу ингибирования можно легко расширить за счет применения других антител, что даст возможность анализировать и более сложные молекулы или смеси молекул.П р и м е р 2. Для того чтобы иметь возможность классифицировать триазины по их активности, определяли их реакционную способность к перекрестной реакции о отношению к соединениям, перечисленным в табл. 2. Для обеспечения высокой специфичности к атразину иммунизацию проводили таим образом, чтобы происходило спсцифическое экспонирование зл,.ильно о, изопропилового и этилового ос гзтков, Б нижеследующей таблице приведены значения степени ингибирования (%) основных предстзвителей отдельных классов вегцеств. Прочная связь антигена с ангитлом обусловливает и сильное ингибирование ферментной системы. Из величины торможения можно определить степень взаимодействия антителз с антигеном.Привсденные в табл, 2 значения ингибирования свидетельствуют о том. что при указанной концентрации (2 части на млрд) селект ивность антител не очень высока, однако перечисленные соединения, которые воздействуют и на фотосистему 11, могут быть определены и иммунологическим ме тодом, С помощью иммуноанализа в соответствии с настоящим изобретением, целенаправленно используя реакционную способность к перекрестной реакции, можно делать выводы о структуре присутствую щих в смеси соединений (сравни пример 1),Формула изобретения Способ определения триазиновых гербицидов, включающий постановку иммунологической реакции испытуемой пробы с 15 антителами, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью повышения селективности и чувствительности способа, используют антител. полученные иммунизацией животных соединениями формулы20К где В 1 - группа НМ(СПН 2 П+1), где и - 0-8; М(СпН 2 в+112, где п 1 - 1-8, галоген или группа ОН, В 2 - группа НЙСчН 2+1, где ц - 0-8, М(СвН 28+)2, где В - 1 - 8, или галоген; Вз - 30 галоген, ЯСН 2 п+1, где и - 0-8, аминогруппаили НМСпН 2 лСООН, где гп - 1-8, причем коньюгировзние производят через заместители В 1, В 2 или Вз, а иммунологическую реакцию осуществляют одновременно или 35 последовательно по меньшей мере с двумяантителами,1838787 13 Таблица 1 Матрица ингибирования Первая серия опытов Вторая серия опытовНезависимо друг от друга имеются всечасти , , К Все части , Ш, О 1 содержатся в одной молекуле ( компонент) Частиинаходятся в одной молекуле (2. компонента)+ = торможение связывания ферментной метки- = отсутствие торможения связывания ферментной метки. Таблица 2 Реакционная способность к перекрестной реакции различных гербицидов при концентрации 2 части на млрдИнгибирование Класс соединений Соединение Триазины 8,3 Метабензтиазурон 4,4 6,7 11,1 ФеназафлорМетрибузинБромазил Анилиды Производные мочевины Производные трифторобензимидазола Аминотриазины УрацилыАтразин Окси-изопропил-атил-триазин Аметрин Дезэтиламетрин Дезизопропиламетрин Метазахлор