Способ распознавания белков

(56) Калинников Д,ДКамышова Т. В, Содержание и коррелятивные связи между аминокислотами зеина, Физиология и биохимиякультурных растений, 1984, т.16, М 1.(54) СПОСОБ РАСПОЗНАВАНИЯ БЕЛКОВ(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биохимическим исследоИзобретение относится к области физико-химической биологии и биотехнологии, а именно к биологической химии, молекулярной биологии, биоорганической химии, и может быть использовано научными учреждениями при изучении физико-химических свойств белков и полипептидов.Целью предлагаемого изобретения ляется расширение функциональных можностей и повышение точно исследований за счет увеличения инфор тивности,Способ состоит в том, что вычисляют среднюю гидрофобность белков с учетом констант для боковых групп аминокислот; определенных при переходе этанол - вода и й-циклогексил-пирролидон - вода. После этого находят коэффициенты корреляции между содержанием аминокислот и гидрофобностью и по этим значениям определяют принадлежность белков к тому или иному классу (фракции),яа- возсти маГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ ГКНТ СССР ваниям, Целью изобретения является расширение функциональных возможностей и повышение точности исследований за счет увеличения информативности. Способ состоит в том, что вычисляют среднюю гидрофобность в калориях на остаток с учетом констант для боковых групп аминокислот, определенных для переходов этанол - вода и й-циклогексил-пирролидон - вода, рассчитывают коэффициенты корреляции между гидрофобностью и содержанием аминокислот, по которым устанавливают принадлежность к тому или иному классу белков,П р и м е р 1. Берется не менее 10 Я различных самоопыленных линий кукурузы, Из зерен каждой линии удаляют зародыши, эндосперм размалывают до тонкого порош- ф ка, отвешивают 10 г муки, приливают 100 мл 70 О 6-ного этанола, содержащего 2 М моче- (Л вины, и помещают на водяную баню на 1 ч, После этого суспензию центрифуги руют при (р 70009 в течение 15 мин. Надосадочную жидкость упаривают под феном до 1/5-1/7 первоначального обьема и используют для влектрофоретичеокого разделения белков в 10%.ном полиакриламидном геле тПАдрт, содержащего 8 Ммочевины. После заверше- а ния электрофореза гели опускают на короткое время в 10-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ), после чего из геля вырезают участки с опалесцирующими белковыми зонами, их гомогенизируют с 2 обьемами 0,1 н.раствора йаОН. Затем гел ь осажда ют центрифуги рова нием, а к надосадочной жидкости приливают равный .10 15 20 25 обьем 40 ф (ТХУ), и белок осаждают центрифугированием при 56000 о 20 мин, После этого белок суспендируют в 6 н. НО, запаивают в ампулы и помещак)т для гидролиза при 110 С в течение 22 ч. Полученный гидролиэат анализируют на наличие аминокислот на аминокислотном анализаторе и вычисляют аминокислотнь 1 й состав, Далее содержание каждой аминокислоты умножают на соответствующие константы, определенные для перехода этанол - вода,Й-циклогексил-пирролидон - вода (данные по А-субфракции проламина в табл.1).Затем суммируют полученные значения и делят на 100 (поскольку расчет велся изначально в молярных Я Тем самым находят среднюю гидрофобность данного белка.Аналогичную операцию проводят со всеми самоопыленными линиями кукурузы, Для того чтобы удостовериться, что выделенные белки являются проламинами, рассчитывают коэффициенты корреляции между средней гидрофобн остью и глицином, фенилалеиином Гакже между треокином глицином, иутаминовай кислотой, пролином, лизином, аргинином и глициниям, Проводят сравнение полученных коэффициентов корреляции с табличными ддя данной культуры тьбл,2). 8 случае совЙздеиия знаков и цифр а пределах ж 1 О следует счит;ть этап белок пролащщом,П р и м е р 2. Берут зреяое зврйа не ееенее 10 линий кукурузы, Иэ зерен удащцог ээродыш и зядосперм, измзймвьют. дО теи" кого порошка, к 10 гмуки грипивают ООмл 0.6%-ного додецилсульфата Ка(ДДСйа), приготовленного на ОЯ 5 Ч Иа-фосфатном буфере, рН 7,0, и ставят на магнитную мешалку на 1 ч, Затем цеитриФугиру 1 ат при 7 ОООя в течение 15 мин. НВДОсадочную жидкость удаляют, а осадок залиаают 20 мл 1,5 ф ДДСИа на тГм же буфере и экстрагируют белок при энергичном помешивании в течение 0,5 ч. Суспензию центрифугируют при 7 ОООд 15 мин. Сулернатант сливают, к нему прилива 1 от этанол до 75 ф концентрации и выдерживают в холодильнике 0,5 ч.После центрифугирования осадок анализируют на содержание аминокислот как описано в примере 1, Дальнеиаие этапы расчета описаны в примере 1 и даны в табл.1 для глютелина, Расчет коэффициентов корреляции осуществляют между значениями средней гидрофобности и глутаминовой кислотой, пролином, глицином, фенилаланином, лейцином, а также между парами аминокислот; аспарагиновой - глутаминовой,глицином - фенилаланином;лизином - аргинином, лизином-аспарагиновой кислотой, треонином - глицином, треонином - Фенилаланином, Проводят сравнение полученных коэффициентов корреляции с табличными для данной культуры (табл.З). В случае совпадения знаков и цифр в пределах 10 следует считать этот белок глютелином.П р и м е р 3. Зрелое зерно не менее 10 сортов пшеницы размалывают до тонкого порошка. Отвешивают 1 г муки, приливают 10 мл 1 М МаО и выдерживают в холодильнике в течение 1 ч с периодическим помешиванием, Центрифугируют при 7000 д в течение,15 мин. 8 насдосадной жидкости определяют аминокислотныи состав со всеми дальнейшими операциями, описанными в примере 1, Проводят сравнение полученных коэффициентов корреляции с табличными данными для пшеницы (табл,2). В случае совпадения цифр в пределах й 10 ОД, следует считать этот белок альбумино-глобулиновой Фракцией. Как следует из табл,2, 3 и 4, эталонные коэффициенты корреляции для распознава-. ния белков являются общими в определенных пределах для всего семейства злаковых, в крайнем случае ограничиваются рамками вида табл.б и 6). Поэтому информация о конкретных сортах или линиях исследуемых растений не имеет значения Формула изобретения Способ распознавания белков, включающий аминокислотнцй анализ белковой пробы и расчет коэффициентов корреляции между аминокислотами, отл ич а а щи йс я тем, что, с целью расширения функциональных возможностей и повышения точности исследований за счет увеличения информативности, в белковой коробе дополнительно вь 1 числяют среднюю гидрофоб- ность, используя константы для боковых групп аминокислот, определенные для переходов этанол - вода и И-циклогексил- пирролидон - вода, определяют коэффициенты корреляции между гидрофобностью и содержанием аминокислот, по которым устанавливают принадлежность белков к тому или иному классу.)659860 лео ОфсЧ СЧ м м м е в л м ф л ф и 0Ю ф о о О м СЧ сч о сч м л е ф О ФФ СЧв 0 ц е щ о оо сО сО е м 1 л т м СЧО О е ЧммоОО сОм Оъ а б с О с сссчвмф м 1О Осчл ми 1 о м 1 л о соо сО ЪО е" СЧ ц 1 в б О сО е моО Мсч мЮ мфе с о. в в есч счосО соЯ О сСаОКбх93 В с 1 СО Счмъ о КОО с л с е - о сч сч сч в е Л МсчсчххО1 х х е х х сх б а5 а б х аЮ С И О х 1 сОоу. й ся х са сО сб 5 3 Б хх 1 1 Э х 3О в ф о СО сч СЧ 0 О О1 м 6 о о о оо о м о о ю сча м о о СОО Ю СЧ Ю - О О Л с м Л СЧм ф - м ВО10 1659860 Таблица 3Коэффициенты корреляции между аминокислотами и средней гидрофобностью пролемннов зерна Вн Признак д растения пщеница ячмень рис кукуруза сорго-0,45 Лизин - аргнннн Лизин - глицнн О, 17 0,60 Табли ца 4.Коэффициенты корреляции меиду аминокислотами и средней гндрофобностьюглютелинов зерна Вид растенияячмень Признак рис, кукуруза сорго шеница Глутамииовая кислота -гидрофобность (Ц) 0,31 0;74 0,78 0,37 0,10 Пролин - гидрофобность (Ц) Глицин - гидрофобность (Э) 0,961659860 Признак Белок глютелинового типа с высоким содержанием пролина Пролин - гидрофобность (Э)Аспарагиновая кислота - пролинАспарагиновая кислота - валинАспарагиновая кислота - феннлаланинТреонин - серииТреонин - лейцинПролин - ФенилаланинАлании - валинАлании - лейцинВалин - енилаланинВалин - гистидинИзолейцин - лизинТирозин - гистидин 0,83, Тирозинаргинин Белок глютелинового типа с повышенным серина и глицина содержанием Пролин - гидрофобность (Э)Треонин - аланииТреонин - валинГлутаминовая кислота - валин 0,72 -О, 64 -0,77 -0,63 0,63 Глутаминовая кислота - лейцин-0,830,630,60 Таблица 5 Коэффициенты корреляции между аминокислотами и гидрофобностью специфических белков зерна кукурузы1659860 13 Таблица 6 Коэффициенты корредяцни между аминокислотаьм и средней гидрофобностъю высокомолекулярногоглютелина зерна пшеницы Признак Валин - гидрофобность (Э)Феннлаланин - гидрофобность (Э) 0,80 0,62-0,7 а Составитель ВДемкинРедактор А.Долинич Техред М,Моргентал Корректор И.Муска Заказ 1839 Тираж 416 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Глутамиионая кислота - гидрофобность (Ц)Пролин - гидрофобность (Ц) Треонин - тирозинИзолейцин - гидрофобность (Э)Изолейцин - лейцин Изолейцин - тирозинЛейцин - тирозинЛейцин - фенилаланинТирозин - фенилаланин 0,72 0,68 0,72 0,69 0,71