Способ определения доступных к усвоению серосодержащих аминокислот пищевых белков

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 5 А 1 9) (11) 51)5 6 01 й 33/4 ТЕН П СВИДЕТЕЛЬСТВУ К АВТОРС А, И. ФеокваиИ,С,68, ч ьзова 77, с. СТУПН ЫХИХ АМИ огии, ме- пищево 6 00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР НИЕ ИЗОБР(71) Институт питания АМН СССР(56) Яебасс ет а 1. Апаус. Восйев. 1р. 192 в 2.Эггум Б. Методы оценки исполбелка животными. - М,: Колос, 19118.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОК УСВОЕНИЮ СЕРОСОДЕРЖАЩНОКИСЛОТ ПИЩЕВЫХ БЕЛКОВ(57) Изобретение относится к биодицине и позволяет оценить белк Изобретение относится к биологии и медицине, а точнее к биохимии и гигиене питания, и может быть использовано для определения полноценности различных источников пищевого белка как традиционного, так и не традиционного происхождения, а также для оценки обеспеченности организма экспериментальных животных серо- содержащими аминокислотами.Цель изобретения - повышение объективности оценки усвояемости аминокислот.Цель достигается тем, что в известном способе, включающем скармливание исследуемого и контрольного белка с известным содержанием модифицированной аминокислоты метионина в составе полусинтетиго назначения или белоксодержащие продукты. Цель - повышение объективности оценки усвояемости аминокислот, Определяют зависимость содержания восстановленного глутатиона в печени крыс от суммы серосодержащих аминокислот в пищевых белках, Математическое выражение этой зависимости представляют в виде уравнения линейной регрессии, с помощью которого рассчитывают содержание доступных (утилизируемых) серосодержащих аминокислот, исходя из содержания восстановленного глутатиона в печени крыс, потреблявших исследуемый белок. Уравнение линейной регрессии: У = 0,226 Х+ 1,77, где У - содержание утилизируемых серосодержащих аминокислот в белке, г/100 г белка; Х - содержание восстановленного глутатиона в печени, мкмоль/г сырой массы. 6 табл,ческого пищевого рациона, забои экспериментальных животных, выделение печени, определение содержания метионина и оценка по его количеству степени доступности серосодержащих, в качестве модифицированной формы серосодержащей аминокислоты цистеина используют восстановленный глутатион, содержание которого определяют спектрофотометрически по поглощению при 412 нм продукта реакции глутатиона с 5,5-дитиобис-(2-нитробензойной кислотой), а содержание суммы утилизируемых серосодержащих аминокислот определяют по уравнению линейной регрессии, У = 0,226 Х + 1,77, при г = 0,91, где Х - содержание восстановленного глутатиона в печени, У - содержание утилизируемых серосодержащих аминокислот в исследуемом белке.Данное изобретение использует открытую закономерность зависимости содержания восстановленного глутатиона в печени крыс от доступности серосодержащих аминокислот в пищевом рационе.Таким образом оценивается весь процесс усвоения и транспорта серосодержащих аминокислот вплоть до включения в состав трипептида глутатиона.Определена зависимость содержания восстановленного глутатиона в печени крыс от содержания суммы серосодержащих аминокислот в пищевых белках и дано математическое выражение этой зависимости в виде уравнения линейной регрессии. Для этого экспериментально было определено содержание восстановленного глутатиона в печени при потреблении крысами ряда источников пищевого белка в сравнении с тем же параметром у крыс, потреблявших казеин как общепринятый стандартный белок с хорошо изученными биологическими характеристиками,Уравнение линейной регрессии позволяет рассчитать содержание суммы серосодержащих аминокислот в исследуемом белке по уровню восстановленного глутатиона в печени крыс, потреблявших этот белок,Для реализации предлагаемого способа было проведено исследование содержания восстановленного глутатиона в печени крыс, в корм животных включали в качестве единственного источника белка испытуемые белковые продукты, характеризующиеся различными аминокислотным составом по серосодержащим аминокислотам, т,е, различным уровнем суммы серосодержащих аминокислот в единице массы белка, Опыты проводили с использованием полусинтетической пищевой смеси, применяемой при исследовании биологической ценности пищевых белков и других экспериментах по медико-биологической оценке пищевых продуктов и источников пищевых веществ.Способ осуществляется следующим образом,Берут взрослых половозрелых крыс - самцов с конечной массой 200 в 2 г в стадии снижения темпа роста, когда не происходит в процессе опыта значительного прироста массы тела и значительного увеличения площади шерстяного покрова, В качестве контрольного белка используют казеин с известным содержанием белка и суммы серосодержащих аминокислот (3,2 г в 100 г 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 белка). Продолжительность содержания животных на рационе не менее 2 нед.Животных забивают декапитацией через 16 - 17 ч после отнятия корма в утреннее время суток. Печень извлекают, быстро взвешивают общую массу и навеску для гомогенизации. Гомогенат готовят в соотношении 1:40 (вес/объем) в 6 О-ной ТХУ, содержащей 2 мМ ЭДТА, в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Гомогенат центрифугируют при 3000 об./мин (5000 9) 15 мин супернатант фильтруют через плотную фильтровальную бумагу,Содержание восстановленного глутатиона определяют по методу ЯебаК Опбзау с реактивом Эллмана (5,5)-дитиобис-(2-нитробензойная кислота). 0,5 мл супернатанта вносят в 2 мл 0,4 М трис-НС 1, рН 8,9 и к смеси прибавляют 0,05 мл 0,01 М 5,5-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты),Через 5 мин замеряют оптическую плотность при 412 нм, Расчет концентрации восстановленного глутатиона в печени проводят по калибровочной кривой, полученной с известными концентрациями восстановленного глутатиона, и выражают в мкмоль/г сырой массы печени (табл.1),Результаты экспериментов, полученные из анализа семи белков с определенным на аминокислотном анализаторе содержанием суммы серосодержащих аминокислот математически обработаны и получено уравнение линейной регрессии концентрации восстановленного глутатиона в зависимости от содержания суммы серосодержащих аминокислот в белке. Уравнение линейной регрессии представляется в следующем виде:У = 0,226 Х + 1,77, г = 0,91 (1)где У - содержание утилизируемых серосодержащих аминокислот в белке, г/100 г;Х - концентрация восстановленного глутатиона в печени, мкмоль/г,Пример 1, Группа крыс(п=6) в течение 6 нед получает рацион, содержащий по калорийности 18% белкового изолята из сои, Контрольная группа крыс (и = 6) получает изоазотистый рацион с казеином 18 О по калорийности,Крыс, предварительно голодавших в течение 16 ч, забивают, быстро извлекают печень, гомогенизируют в 6-ной ТХУ, содержащей 2 мМ ЭДТА в соотношении 1:40 (вес/объем). После центрифугирования гомогената для осаждения белков (3000 об./мин х 15 мин) 0,5 мл супернатанта вносят в 2 мл 0,4 М трис-НС, рН 8,9, и к смеси прибавляют 0,05 мл 0,01 М раствора БТНБ на метаноле,Через 5 мин измеряют оптическую плотность раствора при 412 нм и по калибровочной кривой определяют содержание восстановленного глутатиона, Данные представлены в табл, 2.Содержание серосодержащих аминокислот определяют по формуле (1), зная содержание восстановленного глутатиона.П р и м е р 2. Группа крыс (и = 6) в течение 2 мес получает рацион, содержащий 18 фбелка, представленного белковыми волокнами иэ криля, Контрольная группа (и = 6) получает изоазотистый рацион с казеином, как в примере 1. Обработку тканей и определение восстановленного глутатиона осуществляют как описано в примере 1. Результаты представлены в табл. 3.П р и м е р 3, Группа крыс (и = 6) получает рацион, содержащий 18 белка за счет биомассы дрожжей "Эприн", Контрольная группа крыс (и = 6) получает рацион, содержащий 18 фказеина по калорийности. Обработка ткани печени и определение содержания восстановленного глутатиона проводили так же, как описано в примере 1. Содержание суммы серосодержащих аминокислот, определенных аминокислотным анализом, составляет 3,2 г/100 г белка.Как видно из табл. 4, концентрация восстановленного глутатиона в печени крыс, потреблявших "Эприн", не отличается заметно от концентрации восстановленного глутатиона в печени крыс, получавших казеин.П ри ме р 4. Группа крыс(п=6) получает рацион, содержащий 18 фбелка за счет изолята дрожжевого белка "Паприн". Контрольная группа крыс (и = 6) получает рацион, содержащий 18 фказеина.Обработку ткани печени проводили также, как в примере 1. Как видно из табл. 5, концентрация восстановленного глутатиона в печени крыс, потреблявших паприн, значительно ниже, чем при потреблении казеина, Тем не менее содержание суммы серосодержащих аминокислот в белке "Паприн" по данным аминокислотного анализа 3,7 г/100 г. Однако расчет по формуле (1) свидетельствует, что биологическая доступность серосодержащих аминокислот соответствует содержанию их 3,0 г/100 г.П р и м е р 5. При использовании способа определения доступности серосодержащих аминокислот по известному способу группа крыс (и = 8) получала в течение 12 дн,5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 рацион, содержащий 18 фбелка "Паприн", В течение 5 последних дней кормления учитывали потребление корма и собирали каловые массы. В высушенных образцах кала анализировали суммарное содержание серосодержащих аминокислот на аминокислотном анализаторе. По разнице потребления и экскретируемых с калом серосодержащих аминокислот определяли количество доступных серосодержащих аминокислот в "Паприне". Одновременно в условиях такого же эксперимента исследовали содержание восстановленного глутатиона в печени животных, потреблявших "Паприн". Результаты представлены в табл, 6. Соотношение всосавшихся и экскретируемых серосодержащих аминокислот, выраженное в процентах, характеризует доступность по известному способу, В предлагаемом способе величина доступных аминокислот, найденная по уравнению линейной регрессии, также соотнесена в табл. 6 с количеством аминокислот, определенных в белке аминокислотным анализом,Из данных, представленных в табл. 6, видно, что количественные характеристики доступности серосодержащих аминокислот в белке паприне, полученные обоими способами, близки и составляют 81 - 82 ф .В предлагаемом способе не требуется ежедневного анализа поедаемости корма животными, не требуется сбора каловых масс. Формула изобретения Способ определения доступных к усвоению серосодержащих аминокислот пищевых белков, включающий кормление животных полусинтетическим рационом с исследуемым белком, забой животных, измерение биологических показателей и оценку результатов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения объективности оценки усвояемости аминокислот, в качестве биологического показателя используют содержание восстановленного глютатиона в кислоторастворимой фракции гомогената печени и по уравнению линейной регрессии У = 0,226 Х + 1,77, где Х - содержание восстановленного глютатиона в печени половозрелых крыс с рационом, содержащим 16-18 фисследуемого белка от общей калорийности, устанавливают содержание суммы цистеина и метионина,1718115 10 Таблица 5 б л Исследуемые параметры Предлагаемыйспособ Известныйспособ Содержание Б - содержащих аминокислот в "Паприне" по данным химического анализ 3,70 70 Поеда лени Потре амино ление Бислот,ция Я-сс кало-содержащг/день Экс кис ржащих г/день о,019 Содержание восстановленногоглутатиона в печи,мкмоль/г+0,31 исло 2,0 Составитель С.ПыловаТехред М.Моргентал Корректор Л.Патай Редактор Н.Я аказ 877 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 10 Содержание Я-серосоде в паприне,орма, г/ден елка, г/ден оступных ащих ами Б-АК 4 3,01 81,3