Штамм бактерий aerococcus viridans для получения клонов с оксидазной и редуктазной активностью

СОЮЗ СОЕЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 1)4 1 20 САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ цинск тво СССР 4, 1984. ОСС 118 71 КС ОКСИДА СТЬЮ я к микро ения кегль К ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ АВТОРСКОМУ СВИ(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ АЕКОРМБ ДЛЯ 11 ОЛУЧЕНИЯ КЛОНОНОЙ И РЕДУКТАЗНОЙ АКТИВН(57) Изобретение относитбиологии и касается полус повышенной способностью,ЯО 1406156 популяции и повышенной биологическойактивностью. Цель изобретения - полу"чение штамма бактерий для полученияклонов с повышенной способностью роста популяции и повышенной оксидазнойи редуктазной активностью. В качествекультуры для селекции клонов с ловышенной биологической активностью используется штамм Аегососсоз (Мусососсиз Ьурегохудапз) ВНИИА - 1730 (Коллекция микроорганизмов Всесоюзногонаучно-исследовательского институтаантибиотиков), который . дает клоныс повышенной оксидазной и редуктаэнойактивностью. 5 табл.Изобретение относится к микробиологии и касается получения штамма, который может быть использован для селекции клонов с повьппенной оксидаз 5 ной и редуктазной активностью.Целью изобретения является получение штамма бактерий для получения клонов с повышенной способностью роста популяции и повышенной оксидаэной и редуктазной активностью.Штамм Аегососсця чгЫапя (Мусососсця Ьурегохус 1 апя) ВНИИА У 1730 (СК 308) получен в результате отбора негемолитической колонии на 37-ном 5 кровяном мясо-пептонном агаре среди колоний естественного рассева Мусососсця Ьурегохус 1 апя 167 ЧК, Из отобранной негемолитической колонии получена чистая культура при ее пересеве 20 на мясо-пептонный агар, содержащий 107 лошадиной сыворотки.Штамм Аегососсця чгЫапя (Мусососсця 1 урегохудапя) ОК 308 депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИИ 25 антибиотиков под номером 1730. Штамм имеет характерные свойства.Морфологические признаки. Полиморфен, Основные структуры - кокки удлиненной овоидной формы, грамположи тельные, неподвижные, При электронно- микроскопическом исследовании видны нежные капсулы и внутри клеток крупные включения неправильной формы. При выращивании на средах, обогащенных лошадиной сывороткой, клетки однородно вытянуты и не отличаются полиморфностью. При выращивании штамма на мясо-пептонном агаре и средах, обедненных белком, клетки отличаются значительной долиморфностью: изменяется форма клеток, их расположение. Клетки приобретают неправильную кокковидную форму, овоидную, гантелевидную, булавовидную, зернистую фор му. Клетки могут располагаться беспорядочно, скоплениями, в виде "частокола , розеток", могут располагаться по кольцу. 50Размножение: поперечное деление, дробление.Культуральные свойства. Скуднорастет на мясо-пептонном агаре в видемелких (0,5-1,0 мм в диаметре) плоских бесцветных колоний круглой формы,плотной консистенции. Поверхностьтусклая, сухая, края рсвные сглаженные к поверхности среды. Структура гомогенная или зернистая. Наблюдается врастание в среду.Хорошо растет на мясо-пептонном агаре с добавлением 10/ лошадиной сыворотки с формированием изолированных или сливающихся колоний размером 2- 3 мм в диаметре, круглой формы, слизистой консистенции, блестящие.Хорошо растет на мясо-пептонном агаре с добавлением 0,27, лизоцима. Характеристика роста такая же, как на мясо-пептонном агаре с добавлением лошадиной сыворотки.На 3/-ном кровяном мясо-пептонном агаре рост скудный без проявления гемолиза и изменения цвета окружающей среды.Теллуристый калий, добавленный в мясо-пептонный агар в концентрациях 0,01-0,05/, не угнетает рост штамма.Селенисто-кислый натрий, добавленный в среду в концентрации 0,057, подавляет рост штамма.При росте в мясо-пептонном бульоне с добавлением 107 лошадиной сыворотки штамм формирует придонный и пристеночный осадок с одновременным гомогенным помутнением среды.Штамм хорошо сохраняется на твердых питательных средах: мясо-пептонном агаре, мясо-пептонном агаре с 10/ лошадиной сыворотки и соответствующих жидких питательных средах в течение 2-3 мес при 4 С. Штамм хорошоахранится в лиофильно-высушенном сос-. тоянии, не теряя своей жизнеспособности, по имеющимся данным, в течение 6 лет.Физиологические и биохимические признаки. В качестве источников углерода штамм утилизирует: глюкозу, арабинозу рамнозу, сорбит, лактозу, инозит, ксилозу, дульцит, маннит, сахарозу, Не утилизирует мальтоэу.ДНК штамма содержит 35-427 Г+Ц, Нет цитохром-оксидазной системы и гемсодержащих каталазы и пероксидазы,Хорошо восстанавливает теллур из теллуристого калия и не восстанавливает селен из селено-кислого натрия.Оптимальная температура ростао37 С, температурный интервал роста 20-40 С, время роста 20-24 ч (зависит от вида питательной среды). Перекись водорода не продуцирует. Не является п чдСго антагонистом бактерий.Отношение к антибиотикам: резистентен к стрептомицину - минимальная1406156 Мусососсцз Ьурегохус 1 апз 16773., но отличаются по преимущественному выражению оксидазной или редуктазной активности.Колонии-ревертанты вырастают на среде на 5-10-е сутки. При повторных пересевах рост клонов стабилизируется в течение первых же пересевов и равен 24-48 ч.В табл.1 приведена сравнительная характеристика штамма Аегососсцв чхгЫапз (Мусососсцз Ьурегохуйапз) СК 308 и исходного штамма Мусососсов Ьурегохуйапз 16.7 7 К1Таблица 1 СК 308 167 7 К Свойства Морфология клетокпри росте на мясопептонном агаре Кокки, располагающиеся тетрадамии скаплениями,неправильной формы, грамположительныеМорфология та же(МПА) МПА с 10 лошадиной сыворотки Характер роста на:МПА Рост хороший, колонии (1-2 мм вдиаметре) с ровными краями, выпуклые, несливающиесяРост скудный.Мелкие точечныеколонии Рост скудный, в виде налета, точечные уплощенные колонии с тенденцией врастания в среду МПА с 10/ лошадиной сыворотки МПА (мясо-пептонный бульон) Рост хороший в виде пристеночного и придонного осадкаРост хороший, крупные (2-3 мм в диаметре) колонии красного цвета Рост хороший, колонии среднего размера (1-2 мм в диаметре), неокрашенныеРост отсутствует МПА с 0,05% селенистокислого натрия МПА с 0,01 теллуристогокалия МПА с 0,05 теллуристогокалияМПА с З крови Рост хороший. Колонии черного цвета(1-2 мм в диаметре)Рост очень скудный. Рост обильный. подавляющая концентрация антибиотика(МПК - 500 мкг/мл); димексиду (МПК -3000 мкг/мл). К остальным препаратамчувствителен,Изменчивость. Штамм обладает повышенной изменчивостью морфологииклеток при выращивании на питательных 10средах, обедненных белком.При высеве популяции штамма напитательную среду (мясо-пептонныйагар) вырастают колонии - ревертанты,клОны из которых близки по морфологическим свойствам к исходному штамму Кокки, вытянутыекокки, овоиды,гантелевидные,булавовидные клетки, зерна,грамположительныеОднородные вытянутые кокки, овоиды Рост обильный, сливной. Крупные (2-3 ммв диаметре) колониис ровными краямиРост хороший в видегомогенного помутнения, пристеночного ипридонного осадкаРост скудный, точечные бесцветные колонии Рост средний, колонии среднего размера) 2 Крупные колонии Точечные колонии.(2-3 мм в диамет- Зеленение среды от"ре), зеленящие сутствуеткровяной агар Рост Рост Рост Рост Нет Устойчив Нет Устойчив Нет Нет 5,5 - 6 фОНе разжижает 5,8 - 6,1Не разжижает Не гидролизует Не гидролизует Не гидролизует Не гидролизует Способность расти в присутствии 40%:желчипри рН 9,6при 45 СУсточивость к выдгрживанию:при 60 С30 минв 15%-ном растворе НО. МПК веществ,мкг/мл;ПенициллинОксациллинМетициллинСтрептомицинЛизоцимБиклиноциклинКарбенициллинЦелоспорКефлинЦефалотинПолимиксинРифампицинНитроксолинГрамуринХиноксидинДиоксидинНевиграмонДимексидВосстановление 1%- ной метиленовой сини в молоке Конечное рН в 1%-ном глюкозном бульонеЖелатина Гидролиз:Аргинина Крахмала Утилизацияуглеводов;Арабиноза Рамноза Инозит Ксилоза Сорбит Дульцит Глюкоза 500 500 3,84 2000 250 61,44 3, 84 3,84 30,72 30,72 500 500 15,36 500 500 1000 30,72 7501406156 8Продолжение табл.1 ЛактозаМальтозаМаннитСахарозаСодержание Г+Ц вДНК, штаммов, % 30 - 42 35 - 42 активности. Разная оксидазная и редуктаэная активность получаемых клонов отражается на их свойствах. Чис, 15тые культуры с преимущественной оксидазной активностью характериэуютсяусилением продукции перекиси водорода, превышающей этот признак известного штамма (до 9,8 мМ вместо 2,1 мМсоответственно), повышенным антагонизмом против патогенных бактерий.Чистые культуры с преимущественновыраженной редуктазной активностью 25характеризуются слабой продукциейперекиси водорода (до 0,01 мМ) ивместо с тем сильной антагонистической активностью против патогенныхбактерий.Повышенная изменчивость штамма ЗО СК 308 проявляется в появлении разного типа колоний при его рассеве напитательной среде для индикации оксидазной и редуктазной активностимикроорганизмов, продуцирующих пере кись водорода. Питательная среда Биомасса, мг/см 167 ЧК СК 308 Мясо-пептонный агар (МПА) МПА+10% лошадиной сыворотки ИПА+0,2% лизоцима ИПА+3% 0,8 + О,1 0,3 + 0,05 0,08+0,01 3,1 Ор 2 0,03+0,006 2,3.+0,31 1,3 + 0,1 0,16+0,02 крови Данный штамм является продуцентом, широкого спектра клонов с разной выраженностью оксидаэной и редуктазной 40 Частота измененных колоний в популяциях колоний Вид актиностиК 308 Характерныирост для осно ои массы попуцветнои реакции Красные колонии безцветной реакцииКрасные коляции110 -1,2 10Редуктаэный 2 10 -1 10 Оксидазно- редуктазный лони с ченой нои Штамм СК 308 при выращивании на мясо-пептонном агаре с добавлением 10% лошадиной сыворотки дает обильный рост, значительно превышающий рост известного штамма.В табл.2 представлены сравнительные данные о способности роста штаммов 16717 К и СК 308 при росте на разных питательных средах,Т а б л и ц а 2 еокрашенные Не выраженолонии беэ В табл.3 представлены данные о частоте колоний разного типа в естественном рассеве исходного 16772 и предлагаемого СК 308 штаммов.Т а б л и ц а 31406156 10Продолжение табл. 3Вид актив-. Частота измененных колонийности в популяциях Вид колоний 167 Ю СК 308 ОкраскивокругБесцветные 110 -1 10Оксидазный Характерныйрост для основной массы популяции 0 0 Т а б л и ц а 4 40 Штамм Вид актив- Уровеньности продукцииНО,мМ Оксидазный 2,10,3 167 ЧК 45СК 308ОксидазныйклонРедуктазный 50 КЛОНОксидазно-редуктазныйклон Не выражен 9,8+2,3 ОксидазныйРедуктазныйОксидазно 0,1 + 0,010,5 + 0,021,7+0,4 редуктазный колонии счерной зонойокраски вокругЧерные коло- Оксидазныйнии без зоны окраски вокругЧерные коло- Оксидазный нии с чернойзоной окраски вокруг П р и м е р 1,. Культуру Аегососсця ЫгЫапя (Мусососсця Ьурегохуйапя) СК 308 выращивают на мясо-пептонном агаре с 10% лошадиной сыворотки. Суспензию суточной культуры проращивают в жидкой питательной средео в стационарных условиях при 38 С в течение 10 ч при начальной концентрации клеток 110-1.10 ф на 1 мл среды.Производят высев проращиваемой суспензии на питательную среду для индикации оксидазной и редуктазной актнвности микроорганизмов, продуцирующих перекись водорода. Посевы ино кубируют в течение 6 суток при 37 С, После инкубации отбирают выросшие колонии с преимущественно выраженной оксидазной или редуктазной активностью, Для получения клонов колонии отсевают на скошенный мясо-пептонный агар и посевы инкубируют в течение 36 ч при 37 С. Полученные клоны подвергают исследованию.Для изучения вида преимущественной активности полученных клонов производят посев штрихом суспензий суточных культур (10 клеток на 1 мл физиологического раствора натрийхлорида) на питательную среду для индикации оксидазной и редуктазной активности микроорганизмов, продуцирующих перекись водорода. Посевы инкубируют в термостате в течение 36 ч при 37 С, послеочего производят учет результатов.. Клоны с преимущественной оксидазной активностью дают рост средней интенсивности с окрашиванием в черный цвет 25 штриха растущей биомассы и питательной среды вокруг. Клоны с преимущест. венной редуктазной активностью даютхороший рост с интенсивным краснымокрашиванием штриха биомассы.30 П р и м е р 2. Исследуют уровеньпродукции перекиси водорода у полученных клонов. Штамм СК 308 перекисьводорода не продуцирует.В табл.4 представлены данные о 35 продукции пеРекиси водорода извес 1 нымштаммом 167 ЧК и клонами, полученнымииз штамма СК 308. П Р и м е р 3. Определяют антагонистическую активность полученных клонов п гго в отношении патогенных бактерий родов: РгоСеця, Ряецс 1 ошопая, БСарЬУ 1 ососсця.1406156 12суспензиями тест-бактерий. После24-часовой инкубации учитывают зоныподавления роста,тивностью. Т а б л и ц а 5 Штамм Зоны подавления роста, мм, культур Рвецдошопая ЯгарЬу 1 ососсцв41 культура 30 культур Ргогецв5 культур 167 ЧК 9,2+ 2,2 7,2 ф 1,1 7,9+0,6 31,1 + 1,5 29,7 + 1,3 21 + 1,2 15,3+ 2,3 18,6 ф 2,1 13,2 + 1,7 18,1+2,3 14,0+ 1,5 30,7 + 2,5 Преимущества штамма АегососсцвчггЫапв (Мусососсцв Ьурегохудапв)СК 308 заключается в повышенной возможности селекции широкого спектраклонов с преимущественным выражениемоксидазной или редуктазной активности, что позволяет рассматривать его Составитель В.СоинаРедактор Н,Швыдкая Техред А.Кравчук Корректор И.Эрдейи Заказ 3157/23 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 11Для определения антагонистической активности полученных клонов производят штриховой посев суспензий их суточных культур (1 млрд. клеток на 1 мл физиологического раствора натрийхлорида) на поверхность мясо-пептонного агара. Посевы ин 1 субируют при 37 С 24 ч. В герметичных камерах, исключающих контаминацию окружающей среды, производят опыление посевов СК 308ОксидаэныйклонРедуктазный клонОксидазноредуктазный клон В табл.5 приводится характеристика антагонистической активности полученных клонов в сравнении с известным штаммом 167 7 К. Штамм СК 308 не обладает 1 п чегго антагонистической аккак базовый штамм для селекции биологически активных культур. Формула изобретенияШтамм бактерий Аегососсцв чгЫапв ВНИИА У 1730 для получения клонов с оксидазной и редуктазной активностью,