Способ получения полимера, содержащего звенья о. сн(сн ) сн со-

;05 2 Р 742 С 1 4 С 12 Р 4 ЫЙ КОМИТЕТ СССР обРетений и откРытииГОСУДАРСТВ ПО ДЕЛАМ И ВСЕГОВ эй Я ОП РЕТЕН юл. Ф 6микал Индастриз ПЛ и еленных и ет снижен что укаэывичности и п.фЗ табл(72) Пол Артур Холмс, Стефен Хью Клинз и Леонард Фредерик Райт (СВ)(56) АЛа 11 еп ег а 1. - Епч 1 гопшепа 1 Ясепсе апй ТесЬпо 1 ору, 8, 197р,576-579.МагсЬеэзац 1 Г ег а 1. - "ЕОРАСМасго Р 1 огепсе 1980 Епгегпаг 1 опа 1Яушроэшш оп Масгошо 1 ез Ргерг 1 пГэ,2(1980), р.272-275,Патент США У 3275610,кл. 260-80.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРА, СОДКРжАЩКГО ЗВКНЬЯ -О. СН(СНСН СО- (57) Изобретение позволяет обеспечить получение полимера, содержащего звенья -О, СН(СН )СН СО - с пониженЭ 2- ной кристалличностью и хрупкостью. Процесс ферментации продуцирующих поли-)-оксимасляную кислоту микроорганизмов в водной питательной среде ведут до полного ассимилирования источника азота и/или фосфора, а затем в ферментационную среду вводят 4 - 00 мас.Е ассимилируемого источника углерода, культивирование продолжают до накопления продуцентом 20-70 мас,Х получаемого полимера. В качестве асе симилируемого источника углерода используют кислоты; пропионовую ил изомасляную, или акриловую, или 3-оксипропионовую, или З-хлорпропионовую, %юав или 2-оксимасляную или их водорастворимые соли щелочных металлов, Анализ полученных полимеров, вклеток бактерий, покаэывзоны эндотерм плавленияет на снижение кристаллхрупкости полимера. 2 эИзобретение относится к биотехнологии и касается получения термопластичного полиэфира повторяющейся структуры - О, СН (СН З) СН СО - (,1 ), который быстро крис-аллизуется да относительна высокого уровня (порядка.70% или более) и представляет собой поли-Р-гидроксимасляную кислоту (РНВ)Цель изобретения - повышение тер мопластичности полимера за счет понижения его кристагтлтгчнасти и хрупкосСпособ закгпочается в следующем.В качестве микроорганизмов, праду цирующих пали-р -аксимасдяную кислоту, используют культуры, способные ассимилировать кислоту или ее соль. Предпочтительными являются штаммы иди мутанты бактерий А 1 са 1 з.яепев епгарршз РР МС 1 В 11 б 00, ИС 1 В 11599, 11 С 1 В 11598, ИС 13 11597, АТСС 17699 и штаммы бактерий 11 асагс 11 а эа 1 шопь. - са 1 аг ИР АТСС 19149 и АТСС 21243,25 20 Ферментатцию проводят таким образам, чтобы сухой вес палиэфирсадержащих клеток составлял не менее 5 г/д водной срецы. 1 табы получить, напри- мтер, 10 г/л РНВ-содержащих кгтетак с ЗО содержанием РНВ порядка 40 мас.%, количества питательных вещее"в, подаваемых в ферментер для ограничения рос" та кдетот; устанавливают ттз расттет" поддержания раста б г/л клеток, не содержащих РНВ. Например., если используют азот в качестве ограничивающего рост питательного вещества, та содержанке азота в свабацных ат РНВ бактериальных клетках должно состав лять 8-15 мас,% причем требуемое ко-" личество ассимилируемого азата должна составлять 05-0,9 г,/д, например О,б,2 г ионов аммония на 1 литр.Подходящие кислоты-субстраты долж ны быть растваримы в воде и поэтому могут добавляться как таковые или в виде водно-раствормой соли щелочного металла, Предпочтительными являются нропианавая и кзамасляная кислоты. гидракси-замещтенные производные этих кислот и масляной кислоты, например 3-хларнрапиановая 3-гицроксипрапиановая, а также ненасыщенные кислоты иди их гало-замещенные, такие как акрилавая, метакридавая, 2-хлорпрапионавая кислоты. Используемые кислоты должны давать начало не только повто". ряющимся звеньям (1), когда культивирование проводят в состоянии ограничения роста.Полимер образуется в виде гранулвнутри клеток микроорганизма. Клетки,содержащие полимер, могут быть использованы в качестве формовочного полимера. Желательно отделять полимер отклеток путем их расщепления с последующей экстракцией подходящим растворителем,Выделенный полимер имеет молекуляр.ную массу от 100 000 и выше 200 000.При нормальном метабализме субстрата, например прапианата, последнийпревращается в сукцинат, который дает начало ацетил СаА путем окисленияэлемента трикарбоновой кислоты, ТСА,цикла Кребса, в щавелевоуксусную кислоту с последующим декарбоксилированием. При декарбоксилировании щавеле. -воуксусной кислоты обе концевые кислотные группы удаляются в виде двуокиси углерода. Следовательно, еслипранионат, имеющий атом углерода вкарбаксильной группе, который радиот 1активно мечен, т.е,. 1-С -пропионат,подается к клеткам, то превращениеего в аттетид СоА будет осуществляться с оцновременнай потерей радиоактивности в виде СО . Любое внедре-,Я1ние С в полимер должно быть результатом превращения пропианил СоА в-гт.ттраксивалерил СаА и последующейпагпмеризации.П р и м е р 1. Мугант А 1 са 11.яепеэецсхар 1 из 1 т 1 С 1 В 11599 выращивают ваэробных условиях в 5-литровом периодическом ферментере, содержащем среды следующего состава на 1 л деиониэированной воды:Глюкоза 3,5 г(1 Щ,), БО, 2,0 гМБО 7 Н О 0,8 гБО 0,45 гН РО (1 1 М) 12 млРеБО 7 Н,О 15 мгСледы элементов 24 млРаствор микроэлементов:СпБОт, 0,02ЕпБО бН О 0,1МпБО 4 4 Н О 0,1СаС 1 2 Н О 2,6При достижении концентрации клеток 4,5 г/л, т.е, по истощении ассимилируемога источника азота, в средувносят 1 г/л прапианата натрия, содержащего 1-С -пронианат, совместнот 4с ггооказой и ферментацию продолжаютв течение 5 мин. Клетки отделяютфильтрацией и полимер экстрагируютхлороформом, Меченый углерод обнаруживают исключительно в хлороформномрастворе. Это указывает на то, чтомеченые концевые атомы углерода нетеряются в виде двуокиси углерода.Следовательно, некоторое количествопропионата внедрилось в полимер, отличный от ацетил СоА.Содержание полимера в клетках 607.. Тпл. 122 С. Зона эндотермы плавления 51 Дж ч.П р и и е р 2, Мутант А 1 са 118 епезеиСгоршз ИС 1 В 11599 выращивают в условиях аэрации при рН 6,8 и 34 С в5-литровом ферментере периодическогодействия, содержащем 4000 ил воднойсреды, содержащей на 1 л деионизированной воды:(НН,) 804 4 гМаЯО 7 Н Оь0,8 гКаяо 0,45 гН ЗРО12 мл 25РеЯО 7 Н О 15 млРаствор микроэлементов попримеру 1) 24 млГлюкозу добавляют со скоростью8 г/ч, Количество ассимилируемого аэо"та в среде достаточно для образования 26 г/л несодержащих клеток поли-гидроксимасляной кислоты (РНВ),Через 40 ч клетки отделяют центри-фугированием, сушат вымораживанием иэкстрагируют хлороформом.Содержание полимера в клетках 702.Т.пл. 191 С. Зона эндотермы плавления 127 Дж ч " .40П р и м е р 3, Процесс ведут какв примере 2 за исключением того, чтопри достижении концентрации клеток34 г/л в ферментационную среду добавляют пропионовую кислоту вместо глюкозы со скоростью 2 г/ч. Количествополимера в клетках 707.,П р и м е р 4. Процесс ведут как в примере 3 за исклочением того, что50 в момент достижения концентрации клеток 28 г/л в ферментационную среду вместо глюкозы со скоростью 2 г/ч добавляют изомасляную кислоту в виде раствора, содержащего 150 г/л кислоты, Ферментацию ведут до достижения концентрации клеток 26 г/л РНВ с добавлением глюкозы.Содержание полимера в клетках 5 ОЕ. П р и м е р 5, Процесс ведут как в примере 4 за исключением того, что при достижении концентрации клеток 30 г/л в ферментационную среду подают 4 г 3-хлорпропионовой кислоты в концентрации 50 г/л и продолжают ферментащпо в течение 7 ч при постоянном добавлении глюкозы со скоростью 6,8 г/ч.Количество полимера в клетках 353.П р и и е р 6, Способ осуществляют согласно примеру 2 за исключением того что при достижении концентрации клеток 31 г вместо глюкозы в среду в течение 5 ч добавляют акриловую кислоту со скоростью 4 г/ч с концентрацией 100 г/л.Содержание полимера в клетках 253.В полученнь 1 х полимерах определяют количество сомономерных звеньев гидролизом и газовой хроматографией ме"о цом г-ЯМР1 ЗМолекулярные массы полимеров определяют методом гельпроникаемой хроматографии.Полученные результаты представлены и табл.1.П р и м е р 7, В 5-литровый ферментер загружают 3 л среды следующего состава на 1 л деионизированной воды:НРО (1,М) 1,5 мл МВЗО 7 Н О 0,8 г РеЯО 7 НО215 мгРаствор микроэлементов (как впримере 1) 36 мл Ферментер инокулируют выдержанной в течение 48 ч во встряхиваемой колбе культурой мутанта А 1 са 1 т 8 епез епгор 1 шз ИС 1 В 11599, а затем добавляют 5 г/л глюкозы, Ферментацию проводят аэробно при 34 ОС и регулируемой величине рН 6,8 автоматически с помощью добавления 9:1 объем/объем смеси 4 М КОН и 4 М НаОН, Количество фосфора достаточно для поддержания 8 г/л РНВ клеток свободных от полимера. Когда вся глюкоза утилизировалась (на этой стадии концентрация клеток около 2,5 г/л), добавляют пропионовую кислоту в виде раствора, содержащего 300 г/л пропионовой кислоты, со скоростью О;8 г/ч в течение 54 ч.,Затем клетки собирают, полимер экстрагируют хлороформом, и анали20 5 13751 зируют, Получают следующие результаты: конечная концентрация клеток 20 г/л; содержание полимера 60 Х по весу.Полимер содержит 60 моль Е бета 5 оксибутиратных звеньев и 40 моль 7 бета-оксивалератных звеньев (т.е., где К= этил).П р и м е р 8. Мутант А 1 са 1 депез ецгорЬцз ИС 1 В 11599 выращивают при аэробном культивировании при рН 6,8 и 34 С в 5-литровом ферментере, содержащем 4000 мл водной среды, имеющей следующий состав на один литр деионизированной воды;Глюкоза 17 г(ИН ) 804 гМАМБО 7 Н О 0,8 гН РО (1,1 М)12 млРеЯО 7 Н О15 мгРаствор микроэлементов (какв примере 1) 36 млВеличину рН поддерживают на уров не 6,8 с помощью автоматического добавления смесей 9:1 объем/объем 4 М гидроокиси калия и 4 М гидроокиси натрия, Данное добавление смеси КОН/ ЮаОН для регулирования рН служит так же для снабжения среды для культивирования калием и натрием.Количество ассимилируемого азота (обеспечиваемое применением 4 г/л сульфата аммония) было достаточным для поддержания около 6,5 г/л РНВ:35 клеток свободных от полимера.Так как для получения 6,5 г/л клеток полимера требуется 16 г/л глюкозы, присутствующее количество глюко зы было достаточным для обеспечения небольшого избытка углерода. С помощью регулирования концентрации остаточной глюкозы, а также следов давления растворенного кислорода получа ют ясное указание того, когда системе становится недостаточно ассимилируемого азота. На этой стадии начинают подачу 3-оксипропионовой кислоты в двух экспериментах и 2-окси-масляной кислоты в третьем эксперименте.После завершения добавления кислоты клетки собирают с помощью центрифугирования. Образец центрифугирован ных клеток сушат замораживанием и полимер экстрагируют хлороформом. Полимер анализируют с помощью технологи 43 6ческих приемов газовая хроматограФия/масс-спектроскопия (ГХМС) .Результаты представлены в табл.2,П р и м е р ы 9-13, В каждом примере 250 мл встряхиваемой колбы загружают 50 мл водной среды, содержащей на 1 л деионизированной воды;Глюкоза 10 гКНРО 1,9 гМаН Р)1,56 г(11 Н ) БО 1,8 гМяЯО 7 Н О 0,2 гРеС 1 6 Н Ъ 0,001 г1Раствор микроэлементов (какв примере 1) 1 млВеличина рН водной среды 7,0. Колбу инокулируют Носагд 1.а за 1 шопдсо 1 ог и осуществляют выращивание привращающемся (гироскопическом) встряхивании при 30 С в течение 24 ч. Полученную в результате суспензию затем центрифугируют. Массу клеток, полученную в результате центрифугирования, затем повторно суспендируют в50 мл водной среды, идентичнойсреде, указанной вьппе, за исключением того, что 10 г/л глюкозызаменяют 1 г/л кислоты, а 1,8 г/лсульфата аммония не вносят, Повторносуспендированные клетки встряхиваютв течение 24 ч при 30 С, а затем суспензию клеток центрифугируют. Центрифугированную лепешку или таблеткуклеток промывают дважды метанолом ианализируют на содержание полимера.Полимер анализируют с помощью газовой хроматографии/масс-спектроскопии.Результаты представлены в табл.3,Более высокие содержания полимерамогли быть получены при добавлениидополнительного количества кислотыпосле культивирования повторно сус- .пендированных клеток в течение 24 чи продолжении культивирования,П р и м е р 14. Мутант А.ецггорйцз С 1 В 11599 выращивают путем аэроб-ного культивирования при рН 6,8 и34 оС в 5-литровом порционном ферментере, содержащем от 3500 до 4000 млводной среды, содержащей на одинлитр деионизированной воды:Глюкоза 18 г137517Раствор следовыхэлементов, тех же,что в примере 1 36 млрН регулируют на уровне 6,8 путем5автоматического добавления 9:1 об./об.смесей 4 М хлористого калия и 4 Медкого натрия, Это добавление смесиКОН/ИаОН регулирования рН служит дляподачи в ростовую среду калия и нат- Ория,Количество ассимилируемого азотаобеспечивают 4 г/л сульфата аммониядостаточным для поддержания всегопримерно 6,5 г/л свободных от полимеров клеток НВ.Поскольку для получения 6,5 г/лсвободных от полимера клеток требуется примерно 16 г/л глюкозы, количества присутствующей глюкозы достаточно 20для обеспечения небольшого избыткауглерода.Когда концентрация клеток достигает 8,0 г/л в течение 4,5 ч добавляют 1 г/л 2-оксимасляной кислоты, а 25затем клетки собирают путем центрифугирования. Пробу этих клеток высушивают замораживанием и с помощьюхлороформа экстрагируют полимер. Содержание полимера в клетках 247. Температура плавления 174 ОС, зона эндо"термы плавления 110 Дж г " .П р и м е р 15. В этом примереводная среда и условия Ферментации,т,е. рН, температура те же самые,что и в примере 14, за тем исключением, что концентрация глюкозы составляет 16 г/л и используют лабораторный ферментер непрерывного действия с рабочим объемом 2 л (приблизительно), Непрерывные условия культивирования устанавливают путем непрерывной подачи в ферментер водной среды и непрерывного удаления соответствующего количества среды из Ферментера, обеспечивая среднее время пре.бывания 12,5 ч (т,е. скорость разведения 0,08 ч " ). Затем вводят 3-гидроксипропионавую кислоту в количестве 4,4 г на литр водной среды.После достижения стабильного состояния содержание остаточной глюкозысоставляет 0,6 г/л, остаточная концентрация ассимилируемого азота меньше 1 мг/л и концентрация клеток составляет примерно 10 г/л.55Полимер собирают из удаленной изфермеитера среды путем центрифугирования, сушки замораживанием и экст 43ракции посредством хлороформа. Содержание полимера в клетках 353. Т.пл, 171 С. Зона эндотермы плавления 106 Дж гП р и м е р 16. Повторили пример 15 за тем исключением, что скорости питания регулируют так, чтобы среднее время пребывания составляло 11,8 ч (т.е. скорость разведения 0,095 ч ), и добавляют 3-;гидроксипропионовой кислоты в количестве 2,8 г/л.После достижения стабильного состояния остаточное содержание глюкозы 0,3 г/л, остаточная концентрация ассимилируемого азота составляет меньше 1 мг/л, а концентрация клеток составляет примерно 9 г/л.Содержание полимера в клетках 287 Т,пл, 166 С, зона эндотермы плавления 100 Дж, г 1Анализ определяет температуру стеклования аморфной Фазы, Зоны эндотерм плавления указывают на относительную степень кристалличности,Полимеры из примеров А, В, и С были подвергнуты анализу ядерной маг 13 нитно-резонансной спектроскопией С. Поведение полимеров при плавлении определяют путем дифференциальной калориметрии со сканированием (ПБС) на отожкенных образцах, полученных путем формовки сжатием при 190 С.Полученные полимеры после отжига обладали значительно меньшей степенью кристалличности, чем контрольный сополимер из примера 2.Ф о р м у л а изобретения1. Способ получения полимера, содержащего звенья - О.СН(СНСН СО-, путем культивирования микроорганизма, способного продуцировать поли-р-окси" масляную кислоту, в водной питательной среде, содержащей в течение всего периода культивирования или его части органическую кислоту, или ее производное в качестве ассимилируемого источника углерода и ассимилируемые источники азота и фосфора, о т л и - чающий с я тем, что, с целью повышения термопластичности за счет понижения его кристалличности и хрупкости, культивирование ведут до полного ассимилирования источника азота и/или фосфора, а затем процесс продолжают при использовании от 4 до10 1375143 Таблица Ж мол, звеньев 11, олекулярная масс полученных Мм 10Пример Кислота Хлорчастей гидролизои газовойхроматографией Мм Мп методомЯМР 40 0 Нет 292 2,75 3 Пропионовая 4 Изомасляная 27 33 4,23 207 30 29 2,38 20,6 5 3-Хлорпропионовая.6 ь 5 6 Акриловая 353 2,36 Т а б л и ц а 2 Общее количество добавленной кислоты (г/л) Найденный,заместительПериод, на протяжении которого добавляют кислоту (ч) Кислота 3-Оксипро- пионовая этил и водородв обоих случаях 16,5 2-Оксимасляная этил 100 мас.Х ассимилируемого источника ,углерода в виде глюкозы или пропионовой, или иэомасляной, или акриловой или З-оксипропионовой, или 3-хлорпропионовой, или 2-оксимасляной кислоты, или их водорастворимых солей щелочных металлов,до накопления продуцен-. том от 20 до 70 мас.Х получаемого полимера.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я темчто процесс культивирования после ассимиляции азота и/или Фосфора ведут при использовании в качестве источника углеродасмеси глюкозы и одной иэ вышеуказанных органических кислот или ее солипри содержании в смеси данной кислоты или соли 4-75 мас.Х.3. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что процесс культи вирования до полной ассимиляции азота и/или Фосфора ведут при использовании глюкозы в качестве источникауглерода.12 1375143 Таблица 3 Я,Яа 1 шопсо 1 ог штамм моль, Х Приблизительное соКислота 3-НВ держание полимера,мас.Х АТСС 19149 10 Изомасляная АТСС 19149 2-Хлорпропионовая 2 Пропионовая Изомасляная 10 10 2-Хлорпропионовая 12 П р и м е ч а н и е. 3-НВ - бета-оксибутиратные единицы; 3-НУ - бета-оксивалератные единицы, Составитель И.ПриваловаРедактор А,Лежнина Техред Л.Сердюкова Корректор А 0 бручар Заказ 624/58 Тираж 520 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д.4/5