Способ приготовления трансплантатов органов

АЗ СОЮЗ СожТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 80129 61 К 31/00 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНПАТЕНТУ(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯТАТОВ ОРГАНОВ(57) Изобретение относитсти медицины и касаетсяготовления трансплантатоЦель изобретения - повьппни сохранения биофизичесисходных органов. Для эту рыб, птиц и млекопитаюобрабатывают растворамиили поликарбоновых кислохлорануидридов, взятымиции 0,02-3,2 Х при комнаттуре в течение 3-48 ч.(53) (56) вр 1 апПег Ье го 1 ояе СеАп 1 епйогГБаюуегСгаггв Арр. 282. до С сп 1 аггонг.в,1. 7.Н. еевроп 977,цгу Ю УДАРСТВЕНКЫЙ КОМИТЕТ ССделАм изОБРеТений и ОткРыт 15,02.87. Бюл. К 6Волько Базель АГ (СНВольфганг Фрэель, ХЛихти и Массимо Брун59.089.844(088,8)1.оге 1 адег Р, Огяап Тп, Сота ТЬ 1 еве, 197а 1 гег Р., БсЬпагг Н.2 аввегвагг, ЕЙ 11976. их свойств го изъятые их органы и-, .триили иМ концентра ой темпера12910 Изобретение относится к медицинеи касается способа приготовлениятрансЬлантатов органов,Целью изобретения является повышение степени сохранения биоАизическихсвойств исходных органов.Установлено, что путем внутрии/или межмолекулярной сшивки макромолекул межклеточной матрицы органовили частей органов можно в значитель-ной мере сохранить первоначально имеющиеся биоАизические свойства (в случае протезов сосудов аксиальную ирадиальную эластичность, а такжегладкое состояние внутренней поверхности сосудов). Эта сшивка отличается от известных способов тем, чтоона осуществялется не за счет образования шиААовых оснований, а засчет химически более стабильных амидокислотных связей между аминогруппами, соответств.-чно эа счет сложноэАирных связей спиртовых гидроксильных групп пепгидных целей меж 25клеточной матрицы и карбоксильныхгрупп ди-, три- или поликарбоновойкислоты, которая применяется каксредство свивки,Предлагаемый способ заключаетсяв том, что органы илн части органоврыб, птиц или млекопитающих предпочтительно высших млекопитающих,обрабатывают для сшивки макромолекул межклеточной матрицы за счет образования амидных связей и сложноэАирных связей между аминогруппами,соответственно между спиртовыми гидроксильными группами пептидных цепей и карбоксильными группами ди-, 40три- или поликарбоновых кислот алиАатического, циклоалиАатического,ароматического или гетероциклического ряда.Матрицу можно обрабатывать на дополнительной стадии способа диальдегидом, Обработка диальдегидом служит в основном для связывания не охваченных при сшивке аминогрупп. Благодаря этому повышается избыток отрицательного заряда, который, согласно изобретению, снижает опасность по-,явления тромбоза, например, при трансплантации сосудов,В качестве исходного материалаприменяются, в частности, артерии,вены, сердечные клапаны, а также перикард и т.д., полученные у птиц ивысших млекопитающих. Трансплантаты 20 2могут бытЬ получены как у людей(аутологичные трансплантаты), так иу телят, крупного рогатого скота,лошадей, овец, свиней, гусей, индеек,Аазанов и других животных (инадекватные трансплантаты). При этом предпочтительны органы и части органовживотных из-за их большей доступности, в особенности молодых животных,органы которых обладают превосходнойэластичностью аОрганы и части органов тотчас после изъятия освобождают от окружающих тканей, коллатерали перевязываютлигатурой, Затем их подвергают обработке или до обработки хранят в воде, Аизиологическом растворе поваренной соли или в другом Аизиологическом водном растворе, например твине,80 (полиоксиэтиленовые производныесорбитанолеата), или в неводной жидкости, например диметилсульАоксиде,при 0-15 С с добавлением небольшогоколичества азида натрия,Обязательной стадией способа является сшивка пеп:дных цепей компонентов межклеточной матрицы. Она основана на связывании двух, трех илиболее аминогрупп (преобалающей частью Г -аминогр.;-,п лизиновых радикалов) соответственно спиртовых гидроксильных групп пептидных цепей алиАатическми, циклоалиАатическими,ароматическими или гетероциклическими ди-, трн- или поликарбоновымикислотами благодаря амидокислотнымили сложнозАирным связям,Из укаэанных карбоновых кислотпрежде всего пригодны такие, которые не содержат ни оксогрупп (альдегидных и кетонных групп), ниаминогрупп. В особенности принимаютво внимание такие ди-, три- или по-ликарбоновые кислоты, которые не содержат никаких Аункциональных группкроме карбоксильных и гидроксильныхгрупп.В качестве алиАатических дикарбоновых и трикарбоновых кислот предпочтительны соединения с количествоматомов углерода вплоть до 12,т.е.щавелевая, малоновая, янтарная, яблочная, глутаровая, адипиновая, пимелиновая, пробковая, себациноваяи додекандикарбоновая, винная и слизевая кислоты, в качестве трикарбоновых кислот - трикарбаллиловая илимонная кислоты.Иэ циклоалифатических ди-, триили поликарбоновых кислот пригодны циклопентадикарбоновые и циклогександикарбоновые кислоты, например циклогексан,4-дикарбоновая кисло та.В качестве ароматических дикарбоновых кислот в особенности нужно отметить фталевую, изофталевую и терефталевую кислоты,в качестве ароматических трикарбоновых кислот - тримеэиновую и тримеллитовую кислоты.Из гетероциклических ди-, трии поликарбоновых кислот принимают во внимание фуран,5-дикарбоновую, тетрагидрофуран,5-декарбоновую кислоты, окисленные крахмалы и карбоксиметилцеллюлозу.Расстояние между двумя доступными для сшивки-аминогруппами и целесообразная для осуществления способа растворимость в растворителях в случае упомянутых предпочтительных групп требует более узкого нижнего и верхнего предела, Особенно предпочтительны, следовательно, с одной стороны, алифатические дикарбоновые кислоты с 3-12 атомами углерода, т,е, от малоновой до деканди карбоновой кислоты, С другой стороны,также оправдывают себя более высокомолекулярные поликарбоновые кислоты, например окисленные крахмалы. 35Сшивка может достигаться на основании всех применяющихся в химии способов для образования амидной связи между амино- и карбоксильной группой. В частности, со свободными 40 аминогруппами межклеточной матрицы могут вступать во взаимодействие хлорангидриды, азиды или ангидриды указанных карбоновых кислот, Точно так же свободные ди-, три-, поли карбоновые кислоты могут связываться со свободными аминогруппами межклеточной матрицы с помощью пригодного реагента сочетания (карбодиимиды, например дициклогексилкарбоди имид). Реакция, как правило, осуществляется в безводном органи"еском растворителе, таком как тетрагидрофуран, диоксан, пиридин, диметилформамид, диметилацетамид, диметялсульфоксид и гексаметилфосфортриамид, или в смеси двух или более растворителей,Если используется водорастворимьгреагент сочетания, например И-этил-(3-диметиламинопролил)-карбодиимид-гидрохлорид, то в качестверастворителя пригодна также вода.Такого рода стабилизированныеорганы и части органов могут подвергаться дублению или сшивке (факультативной) на второй стадии способа с помощью диальдегида, в результате чего оказывается воздействиена возможно еще свободные аминогруппы коллаген-пептидной цепи с обраэован 1 ем шиффовых оснований, Эта обработка предпочтительна также потому, что получающиеся с помощью глутарового диальдегида протезы ужепрактически стерильны,В качестве диальдегида пригоденлюбой диальдегид, предпочтительныформальдегиды, диальдегидкрахмалы ипрежде всего глутаровый диальдегид,Реакция с диальдегидом осуществляется предпочтительно в водном растворе (например, по способу согласнопатенту Швейцарии Р 595105 или патенту СЯА В 3093439),Полученные трансплантаты затемтщательно .промывают водой, стерилизуют и хранят вплоть до примененияв запаянных пластмассовых мешках,Стерилизацию продуктов осуществляютисключительно химическим путем с помощью пропен,2-оксида (см. далеепод названием К-раствор), пропиолоактона (лактон ф-окси-пропионовой кислоты) или этиленоксида.Имплантацию протезов осуществлялигибридным собакам весом по 20-25 кг: а) на обеих Аггегдав Гешога 1 ев каждой собаки дистально паховой связки по методу Р.Ма 1 гег и сотр, (Не 1 ч,сМг.Аса 46 (1979), 81 и последующие); б) на обоих каротидах; в) на Аогга аЬдошдпа 11 в каудально отхождению Аггегза гепо 1 ев (Р,Ча 1 гег апд Н,БсЬппГг, Пег Ьееего 1.ояе СеГаввегвас.г, с. 30, Ед 1 г 1 о Сопдог. Ац 1 епдогк, 197 б); г) на инфраренальной Чепа сача 1 пегз.ог по методу Я.НогвеЬ и сотр, (1,опцепЬесЕв АгсЬ. СЬдг 344 (1978), 225 и последующие). Для сравнения осуществлялись параллельные опыты с протезами из тефлона (Р) и дакро,на (Р), а также с пупочными венами, которые дубили только с помощью глу- тарового диальдегида, Измеряли про29102 55а), Стерилизация с помощью пропен,2-оксида,Артерии ка 16-24 ч (возможно также и на более длительное время) поцент зякрьтия имплантлта спустяшесть недель. Место имплантации ца тазобедренном суставе собаки подвергается высокой механической нагрузке. 5Показательны сравнительные результаты, Имплацтаты из тефлона (Р) и 11 пЬ 11.со 1 чепе имеют закрытие 1003, имплантаты из дакрона (Р) имеют закрытие 77, в то время как предлага емые имплантаты согласно примеру 9 имеют закрытие 507, Полученные при сравнительных опытах значения статистически достоверны.В опытах, продолжавшихся в течение б мес при физиологически благоприятных условиях, а именно ца Агхка СасСя процент закрытия им плантатов согласно примеру 9 упал до 207 (получекное значение стати стически достоверно). Бо время опытов, продолжавши .я 6 мес в нфра - рекалькой области, тромбозов не наблюдали.25П р и м е р 1. Каротиды теленка освобождают от окружающей связующей ткани и перевязывают коллатерали. После механической препарации их промывают деионизиоовоцной водой. высушивают фильтровальной бумагой, насаживают на стклянную палочку диаметром, например, 3 мм и для обезвоживания помещаот в запоякеккый тетрагидрофураном мерный цилиндр, Каждь е 1-2 ч содержимое мерного ци линдра встряхивают, Спустя 5 ч жидкость заменяют новым тетрагидрофураном. Спустя следующие 2-3 ч стекляцную палочку удаляют.На следующий день артерии вносят в 27-ный (вес/объем) раствор хлорангидрида адипиновой кислоты в тетрагидрофуране и оставляют в этом растворе 24 ч. Раствор встряхивают или заставляют циркулировать с помощью насоса. После этого артерии помещают в чистый тетрагидрофуран, затем в смесь тетрагидрофурана с водой (1:1 по объему) и наконец в забуференный фосфатом раствор поварекной соли и оставляют в нем на 30-60 мик, В результате артерии готовы к стерилизации или к гидролизу с помощью фицина, папаина или тому подобного. 0 6мешают н 17,-ный (вес/объем) растворпропец,2-оксида в смеси этанолас водой (1:1 по объему). Затем их встерильных условиях помещают в РВБраствор и вместе с ним запаивают встерильный пластмассовый мешок.РВ 8-раствор готовят следующим образом.В 40 л воды расторяют 320 г хлористого натрия, Я г хлористого калия, 51,2 г дигидрата вторичногофосфата натрия, 8,0 г первичногофосфата калия, 5,2 г дигидрата хлористого кальция и 4,0 г гексагидратахлористого магния,Для хранения артерий в смеси этанола с водой достаточно их поместитьв указанный водно-спиртовый растворпропиленоксида и вместе с жидкостьюзапаять в пластмассовый мешок.б), Стерилизация с помощью пропиолоактона (лактоц Р -скси-пропионовойкислоты),Примерно в 900 мл деионизированкой воды растворяо. следующие соли:0,236 г хлористого натрия, 0,248 гхлористого калия, 0,363 г дигидратахлористого кальция, 0,190 г гексагидрата хлористсго магния и 0,172 гпервичного фосфата калия. С помощьюпримерно О,. к водного раствора едкого натра доводят рН раствора до /,4.Затем в оастворе растворяют 11,782 гбикарбоната натрия и объем доводятдо 1000 мл путем добавления воды,Непосредственно перед стерилизациейартерий к 1 л этого раствора добавляют 8,6 мл (10,83 г) кропиолактона,в смесь помещают артерии и запаиваютих вместе с жидкостью в пластмассовый мешок.в). Стерилизация с помощью этиленоксида.Помещенные в раствор РВИ или физиологический раствор поваренной соли артерии вместе с жидкостью запаивают в пластмассовом мешке, Стерилизуют тем, что закрытый пластмассовый мешок в аппарате для стерилизации обрабатывают газообразной окисью этилена 4 ч при 25-30 С. П р и м е р 2. Четыре механически отпрепарировакные артерии теленка по отдельности насаживают на стеклянные палочки толщиной 4 мм и помещают в заполненный пиридином мерный цилиндр емкостью 500 мл. Спустя час оки становятся настолько жесткими, 1291020что стеклянные палочки можно вынуть,Жидкость сливают и заменяют новымпиридином, Спустя час пиридин ещераз обновляют. Спустя еще час артерии вносят в смесь, которая готовится следующим образом: н смесь из98 мл пиридияа и 2 мл диметилформамида при перемешинании вносят шприцем 2 мл (2,5 г) хлорангидрида ади 10пиноной кислоты, при этом образуется мелкий осадок адипилпиридинийхлорида, Когда он отстаивается, егонакрывают ситом из фарфора. Затемартерии помещают на сито так, чтобыони были полностью покрыты жидкостью,однако не соприкасались с осадком.Спустя 18 ч артерии вынимают из жидкости и погружают на 30 мин в К-раствор (см.пример 6). Затем их промывают четырехкратно 0,05 н стерильным водным раствором уксусной кислоты и дважды стерильным фосфатным буфером (1/15 молярным) с рН 8, Их помещают в стерильный РВБ-раствор ивместе с этой жидкостью запаивают ипластмассовый мешок.П р и м е р 3. 10 артерий теленкамеханически препарируют и на 3 чпомещают ветикально в заполненныйтетрагидрофураном мерный цилиндр емкостью 500 мл, Затем их по отдельности помещают в стеклянные трубкишириной примерно 2 см и встряхиваютих (каждая с 40 мл 0,067.-ного (нес/объем) раствора адипиновой кислотыв смеси тетрагидрофурана с водой(4:1 по объему), Спустя 1 ч добанляют по 40 мл 27.-ного (вес/объем)раствора дициклогексилкарбодиимида в тетрагидрофуране и путем встряхивания и колебания смешивают с ужеимеющимся раствором, Спустя 3 ч артерии помещают в К-раствор (см.пример 6), На следующий день их промывают по 40 мл стерильной смесиэтанола с водой (1: 1 по объему),стерильного фосфатного буфера (1/15молярного) с рН 8 и помещают их встерильный РВБ-раствор, Наконец ихвместе с РВБ-раствором запаивают впластмассовый мешок.1П р и м е р 4, 10 артерий теленкапосле механическогс и:епарированияпомещают в заполненный диметилформамидом мерный цилиндр емкостью500 мл. Спустя 3 ч их по отдельностипомещают в стеклянные трубки с внутренним диаметром примерно 2 см и заливают их по 40 мл 0,067-ного(вес/объем) раствора адипиновой кис.лоты н смеси диметилформамида с водой (4:1), Спустя час добавляют по40 мл 2 Е-ного (по объему) растворадициклогексилкарбодиимида в диметилформамиде и смешивают путем встряхивания и колебания с уже введеннымраствором адипиновой кислоты, Спустя 3 ч жидкость из каждой трубкивыливают и заменяют по 80 мл К-раствора. На следующий день артерии промывают по 40 мл стерильнойсмеси этанола с водой (1: 1 по объему) и стерильного фосфатного буфера (1/15-молярного) с рН 9, Наконец их вносят н стерильный РВ 8-раствор и вместе с ним запаивают в пластмассовый мешок,П р и м е р 5, 4 артерии теленкаосвобождают от связующей ткани и перевязывают коллатерали. Затем артерии вносят на 2 ч в 60 мл 0,02 Х-ного (нес/объем) водного раствора адипиноной кислоты. Затем их помещаютв 60 мл водного раствора, которыйсодержит адипиноную кислоту н концентрации 0,2 г на литр и И-этил-К --(3-диметиламинопропил)-карбодиимид-гидрохлорид н концентрации 25 г налитр. Спустя 20 ч артерии вносят вК-раствор, спустя 24 ч - н стерильный РВБ-раствор, Вместе с ним ихзапаивают н стерильный пластмассовый мешок,П р и м е р 6. Механические препарированные артерии помещают на 2 чв 60 мл раствора 0,17,-ного (вес/объем) пробковой кислоты в воде, затеми 60 мл водного раствора, который налитр содержит 0,24 г пробковой кислоты и 25 г И-этил-И -(3-диметиламинопропил)-карбодиимид-гидрохлорида.Спустя 20 ч артерии вносят в Кв .раствор, спустя следующие 24 ч - встерильный РВИ-раствор и вместе сним запаивают в стерильный пластмассовый мешок.К-раствор готовят следующим образом,Смешивают 720 мл воды и 720 млэтанола, К этому раствору добавляют16,9 мл (14,1 г) пропен,2-оксида.Этот раствор нсегда готовится свежими используется непосредстненно послеприготовления для стерилизации.П р и м е р 7. Каротиды телят,как описано н примере 1, механическипрепарируют и промывают водой, затем помещают в 200 мл тетрагидрофурана. Спустя 7 дней артерии помещают в 3,2 Х-ный (вес/объем) раствор дихлорангидрида доденкарбоновой кислоты в тетрагидрофуране и оставляют их лежать в нем 48 ч. Затем их помещают на 16 ч в тетрагидрофуран, на 8 ч в буферный раствор тетрагидрофурана (1:1 по объему) с рН 4,5 и на 1 день в водный буферный раствор с рН 4,5. Теперь они готовы к стерилизации или к гидролизу.П р и м е р 8. 10 артерий телят после механической обработки помещают в плоскую чашку и заливают 500 мл 1 Я-ного раствора лимонной кислоты в воде (вес/объем). Через 2 ч артерии помещают в мерный цилиндр на 1500 мл в вертикальном положении и заливают их раствором 0,2 г лимоннойкислоты и 10 г И-;тилен-М -(3-диметиламинопропил) -карбодиимид-гидрохлорида в 500 мл воды, Через день артерии промывают в течение 20 мин в проточной воде и затем помещают в стерильный физиологический раствор поваренной соли. Вместе с физиологическим раствором артерии помещают в пакетики из полимерного материала, пакетики запаивают и стерилизуют окисью этилена, как это описано в примере 1.П р и м е р 9. 10 артерий телят после механической обработки натягивают на стеклянные стержни и устанавливают в мерный цилиндр на 500 мл, заполненный насыщенным водным раствором 0 Ь-камфарной кислоты (ВЬ,2,2- -триметилциклопентан,3-цис-дикарбоновая кислота), Через 4 ч артерии, не снимая их со стержней, помещают в мерный цилиндр на 500 мл и заливают раствором 0,25 г Ш-камфарной кислоты и 10 г И-этил-М -(3-диметиламино-пропил)-карбодиимид-гидрохлорида в 500 мл воды. Через 4 ч стержни осторожно вытаскивают иэ артерий, а через день артерии в течение получаса промывают проточной водой, помещают в стерильный Физиологический раствор поваренной соли и вместе с ним запаивают в пакеты из полимерного материала, после чего сразу же стерилизуют окисью этилена, как это описано в примере 1.П р и м е р 10. 100 коллатералей сонных артерий телят и быков длиной 2-4 см каждая укладывают,в химическийстакан объемом 200 мл и заливают200 мл тетрагидрофурана. В течениесуток жидкость дважды заменяют свежими порциями, Примерно через каждые.2 ч содержимое стакана тщательно перемешивают, На следующий день жидкость заменяют на раствор 20 мл/лхлорангидрида адипиновой кислотыи 38 мл/л триэтиламина в тетрагидрофуране. Время от времени стакан переворачивают для перемещивания его содержимого. На следующий день жидкость15из стакана сливают и заливают коллатерали 200 мл тетрагидрофурана. Через 2 ч его заменяют на смесь тетрагидрофурана и цитратно-Фосфатногобуферного раствора с рН 4,5 в объемном соотношении 1: 1, а еще через202 ч на чистый цитратно-Фосфатный буферный раствор с рН 4,5, Через деньколлатерали промывают в течение четверти часа проточной водой, помещаютв стерильный Физиологический раствор поваренной соли в пакет из полимерного материала, пакет запаиваюти стерилизуют окисью этилена, какэто описано в примере 1,П р и м е р 11. Вырезают из перикарда теленка. 10 круглых кусков диаметром 3 см и выдерживают их в течение получаса в воде, Каждый иэ кусков укладывают на стержнеобразныйщаблон диаметром около 8 мм, высту 35пающий примерно на 2 см из пластины.После этого куски перикарда прижимают со всех сторон в направлении отцентра с помощью гладкой моделирую 40 щей деревянной палочки к шаблонутаким образом, что в результате онипринимают Форму мешочков диаметромоколо 8 и высотой примерно 12 сш.Если шаблоны с надетыми на них кус 45 ками перикарда поместить на 20 минпод 100-ваттную нагревательную лампу, то они высыхают и могут быть сняты с шаблонов, сохраняя при этомсвою Форму. Затем их помещают вхими 50ческий стакан с 150 мл тетрагидрофурана, следя при этом за тем, чтобыони полностью были покрыты жидкостью,Через 3 и 6 ч тетрагидрофуран встакане заменяют свежими порциями.На следующий день тетрагидрофуранзаменяют 3,5 Х-ным раствором (вес/объем) хлорангидрида додекановой кислоты в тетрагидрофуране и оставляют внем мешочки из перикарда на 24 ч.2 1291020 Составитель И,ТарееваРедактор М,Циткина ТехредМ.Ходаиич Корректор Т.Колб. Заказ 7920/60 Тираж 596 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д,4/5Производственно-полиграФическое предприятие, г.ужгород, ул,Проектная,4 Затем жидкость в стакане заменяютна чистый тетрагидроФуран, через 4 ч -на смесь тетрагидроФурана и цитратно-Фосфатного буФерного раствора срН 4,5 в объемном соотношении 1: 1,а еще через 4 ч на чистый цитратноФосатный буФерный раствор с рН4,5. На следующий день мешочки иэперикарда помещают в Физиологическийраствор поваренной соли, затем вместе с этим раствором в пакеты изполимерного материала, пакеты запаивают и стерилизуют с помощью окисиэтилена. Обработанные таким образомкусочки перикарда можно испольэовать для замены поврежденных барабанных перепонокФормула и э о б р е т е н и яСпособ приготовления трансплантатов органов, включающий изъятие органов у животных и обработку их растворами химического реагента,о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения степени сохранения био- Ю Физических свойств исходных органов,в качестве химического реагента используют ди-, три- или поликарбоновые кислоты или их хлорангидриды концентрации 0,02-3,27,а обработку ведут при комнатной температуре в течении 3-48 ч.