Способ получения полипептидов

О П И С А Н И Е (и 980615ИЗОБРЕТЕН ИЯ Сотоз СоветскихСоциалистическихРеспублик Н ПАТЕНТУ(23) Приоритет - (32) 08,. 12. 77 С 07 С 103/52д 61 К 37/02 1 осударетаелнвиф квинтет СССР ло делам лэобретенкй и аткрытий(53), УДК 547 964. .4.07(088.8 ) Дата опубликования описания 07. 12.82,72) Автор изобретения Иностранец Гидеон Гольдстейн(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ Изобретение относится к способу получения новых полипептидов - биологическиактивных соединений, которые могут быть применены в медицине.Известен метод твердофаэного синтеза, который широко используют в химии пептидов. Сущность метода состоит в присоединении С-концевой аминокислоты, синтезируемой пептидной цепи к твердому полимеру ковалентной связью и последовательном присоединении остальных аминокислот ступенчато (одна за другой ) пока не будет "собрана" .вся необходимая аминокислотная после" довательность 1 .Известен также метод, при котором синтезированный пептид .удаляют с полимерной подложки и отщепляют оставшиеся защитные группы. Метод позволяет в процессе синтеза удалять побочные продукты, избыток реагентов фильтрованием и отмывкой. В качестве носителя используют различные нерастворимые полимеры, содержащие в своей структуре функциональные группы, при 2годные для ковалентного присоединенияпервой защищенной аминокислоты, такие .,как целлюлоза, поливиниловый спирт,полиметилметакрилат, сульфированныйполистирол, хлорметилированный сополимер стирала и дивинйлбензола, бензгидриламинная смола и т,п Не вступающие в реакцию функциональные группы аминокислот, из которых строится10 пептидная цепь, блокируют, используяобычно применяемые в пептидной химиизащитные группы, например третбутилоксикарбонильная, бенэилоксикарбонильная, бенэильная и т. и Деблокирова 15 ние защитных групп конечной пептиднойцепи осуществляют обычно с помощью от.- носительно мягкой обработки защищенного пептида кислотой (например, три"фторуксусной ). Использование извест"ав ных методов синтеза позволяет получить полипептид, обладающий своеобразными фармакологическими свойствами 21.Цель изобретения - получение ново,го полипептида,3 980615 Поставленная цель достигается способом получения полипептидов общей Формулый - Х.уз - у - 01 п - й, (1 ) где Х; 5, 1 А 1 а, ОА 1 а;У; 5 е Ьсд-, ОА 1 а, 2 Ме А 1 а",В: Н, СНСО, С Нзаключающийся в том, что замещенный по аминогруппе 1.-глутамин присоединяют к нерастворимой полимерной смолековалентной связью предпочтительно всреде абсолютного этанола при +80 С;удаляют с-аминозащитную группу отглутамина обработкой продукта присоединения аминокислота-полимерная смола трифторуксусной кислотой, деблокированную аминогруппу 1.-глутамина подвергают взаимодействию с У-аминокислотой, защищенной по Ы-аминогруппе, 20используя предпочтительно карбодиимидный метод, после удаления о-аминозащитной группы обработкой трифторуксусной кислотой, продукт вводят во взаимодействие с (.-лизином, защищенным по д-аминогоуппе,.предпочтительно используя карбодиимидный метод, полученную защищенную по с-аминогруппе трипептидполимерную смолу деблокируют обработкой трифторуксусной кислотой и три- зО пептид-полимерную смолу конденсируют с й- К-замещенной с Х-аминокислотой;защищенной по ее с;аииногруппе, предпочтительно используя карбодиимидный метод, обработкой полученного продук- з та кислотой, если В-ОН, или аммиаком в диметилформамиде, если В-ИН отщепляют пептидную цепь от смолы и защищенный пептид деблокируют обработкой трифторуксусной кислотой, и в случае использования бензгидриламиновой смолы (В-ИН ) независимо от обработкипродукта кислотой или аммиаком. Предпочтительным вариантом способа является использование в качестве полимерной смолы хлорметилированного полистиролдивинилбензола и бензгидриламиновой смолы,П р и м е р 1. При получении полипептида используют о-нитрофениловый эфир Мтретбутилоксикарбонил.-глутамина, М-третбутилоксикарбонил-й- -хлорбензилоксикарбонил.-лизин, й-третбутилоксикарбонил-О-бензил.-серин, М-третбутилоксикарбонил"-аланинЛЫВ этих реагентах третбутилоксикарбонильная группа в дальнейшем будет обозначаться сокращенно как ВОС-груп 4па. Реагенты для определения аминокислотной последовательности марки."Секвенал" ("5 е 1 цепа 1"), а именно: дициклогексилкарбодиимид, флуорескамин и смола для твердофазного синтеза, Смола, использованная для синтеза, представляла собой хлорметилированную полистирол-дивинилбензольную смолу в виде гранул размером 200-400 меш, содержащую 1 Ф дивинилбензола и 0,75 ммоль хлора на грамм смолы, Для получения полипептида 2 ммоль с-ВОСглутамина этерифицируют 2 ммоль хлорметилированной смолы в среде абсолютного спирта, содержащего 1 ммоль триэтиламинг, вОтечение 24 ч при 80 С. Полученную смолу, содержащую остато ВОС-глутамина, присоединенный к ней сложноэфирной связью, отделяют фильтрованием, промывают абсолютным спиртом и сушат до постоянного веса, Затем аналогичным образом присоединяют другие о-ВОС- "аминокислоть 1 которые сочетают с деблокированной о-аминогруппой на конце пептидной цепи, связанной с полимерной подложкой (смолой ), в надлежащей последовательности, используя в качествеконденсирующего (сочетающего ) реагента эквивалентное количество дициклогексилкарбодиимида. В результате этой последовательности реакций был получен полипептид формулы (1), причем после каждой реакции сочетания отбирают аликвоту смолы, которую анализируют с помощью флуорескамина на полноту протекания реакциии, если при этом обнаруживают положительную флуоресценцию, что свидетельствует о неполном сочетании, то реакцию сочетания повторяют с той же е-защищенной аминокислотой. В результатенескольких таких сочетаний получаютпромежуточный продукт - смолу содержащую защищенный тетрапептид, Эту пептидсодержащую смолу расщепляют с одновременным удалением защитных групп в аппарате "Ке 1-Р, используя безводный фтористый водород при 00 С в течение 60 мин,в присутствии 1,2 мл анизола на грамм пептидсодержащей смолы. Реакционную смесь, содержащую пептидный продукт, промывают безводным диэтиловым эфиром и экстрагируют водной.кислотой, Полученный экстракт лиофилизируют и высушенный таким образом пептид хроматографируют на Био-Геле Р в 1 М уксусной кислоте. Полученныйполипептид имеет 983-ную степень чис5 9806 тоты, характеризуется аминокислотной последовательностьюН - А 1 а - .уз - 5 ег - М О - ОНДля идентификации используют тонкослойную хроматографию и электрофо рез, при которой тонкослойную хроматографию проводят на пластинках с тонким слоем силикагеля (силикагель компании Бринкман с флуоресцентным индикатором) толщиной О, 1 мм, Пластинки разме 0 ром 20 Ф 20 см. Хроматографирование проводят с использованием 30 мкг образца исследуемого пептидного продукта и следующих элементов1М н-бутанол: пиридин: уксусная кислота: вода = 30:15:3:12К Г этилацетат:пиридин:уксусная кислота:вода = 5:5:1:3Рт этилацетат:н-бутанол:уксусная кислота: вода = 1: 1: 1: 1. 20Элект роферетическое исследование проводят на образце весом 100 мкг с использованием 3-миллиметровой Ватмановской бумаги (11,5 х 56,5 см) и пиридин-ацетатного буферного раствора с рН 5,6. Электрофорез осуществляют при Пример, М Х у О-Аа ИН 2 ЯН 5 аг О.-А 1 а О-А 1 а НН 2 О-Аа 5 аг 2 5 аг 2-Ие А 1 а НН 2 Н,5 аг 5 аг ОН 6064 (производства фирмы Истмен Кодак, размером 2020 см) и использованием в качестве элюента системы растворй"Я телей н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода в отношении 15:10:3:12 ( Й)Электрофорез проводят на образцах весом 50 мкг, которые наносят на бумагу Ватман У 3 (размер листа 5,7 ф м 55 см), используя пиридин-ацетатный буферный раствор и разность потенциалов между электродами 1000 В; электрофорез в этих условиях продолжают в течение 1 ч. Для опрыскивания тонкослойных хроматограмм и электрофоретограмм с целью проявления пятен испольДля идентификации и доказательства гомогенности полученных пептидов использованы тонкослойная хроматография и электрофорез, которые проводят следующим образом: для тонкослойной хроматографии использованы образцы продуктов весом 20 мкг, хроматографию проводят на пластинках с тонким слоем силикагеля (Кизельгель фирмы Керк, ФРГ, размер пластинок 5 м 20 см), используя в качестве элюента систему растворителей: н-бутанол-уксусная кис..Я лота - этилацетат-вода в объемном отношении 1: 1; 1: 1, а также на пластинках с тонким слоем целлюлозы марки 15 6найряжении 1000 В в течение одного часа. Для опрыскивания тонкослойных хроматографических пластинок и электрофореграмм используют реагент Паули и раствор нингидрина. В итоге получа" ют следующие результаты; 1 К = вещество осталось на старте, Й вещество осталось на старте и В0,336.Элект"зрофорез в указанных условиях приводит к перемещению вещества на 94 см по направлению к катоду. Примеры-У,Используя способ, аналогичный вышеописанному, для получения замещен" ных полипептидов, синтезирован ряд полипептидов общей формулыуВ - Х - .уз -У - 61 О - В Эти пептиды получают твердофазным, методом, с использованием в качестве твердой полимерной подложки бензгид" риламинной смолы,Результаты получения этих пептидовпредставлены в табл, 1.1Таблиц а 17 980615 8зуют реагент Паули и раствор нингид- ществ при электрофорезе приведены отрина. носительно тех же велицин для эталонРезультаты получения представлены ного пептида Н-Аго.уз-Азр-Ча 1-7 угв табр, 2 (величины М и пробег ве- -ОН). Таблица 2 Е Электрофорез Пример, Ь Ниграцияпродуктов Степеньчистотыпродуктов,ф 0,44 0,68 2,07 0,60 178 0,71 2,10 98 0,88 98 98 056 СНСОаг - 1.уз -5 аг - 61 п - ОН 45 В результате использования аналогичных методик тонкослойной хроматографии и электрофореза для исследования пептидного соединения, полученного в примере 1 Ч было показано, цто для него свойственны следующие характеристики: й =10, 155 ), КЕ вещество остается .на старте, В = 0,265; при1элвктрофорезе в указанных выше условиях вещество перемещается от старта на расстояние 13,1 см по направлению к катоду.П р и м е р Ч . Тетрапептидсодержащие смолы имеющие защищенные остатки лизина и серина, погеченные, как. описано в примерахи 1 С 1, ацилируют уксусным ангидридом в соответствующих условиях, после чего удаляют защитные группы и отщепляют полимерную 4 О подложку. В итоге получают следующие ацилированные производныеСНзСО - А 1 а - .уз - 5 ег - 01 п - ОН П р и м е р Ч 1,Защищенные тетрапептидные смолы, полученные,как описано в при" мерахи 11,переэтерифицируют с метилатом натрия в метиловом спирте в условиях, О обеспечивающих протекание реакции переэтерификации, приводящей к отщеплению пептидных продуктов от полимерной подложки. Последующее удаление защитных групп от полученных продуктов пе реэтерификации приводит к получению этерифицированных пептидных производных, соответствующих формулам Н - А 1 а - 1.уз - 5 ег - 61 пОСНзН - 5 аг - 1.уз - 5 аг - 61 пОСНзП р и м е р Ч 11. Тетрапептидсодержащие смолы, имеющие защищенные остатки лизина и серина, и полученные, как описано в примерахи 1, подвергают обработке диэтиламином с целью отщепления защищениых пептидов от твердой полимерной подложки в условиях, обычных для проведения реакций такого рода. Последующее удаление защитных групп приводит к получению следующих диэтиламидных производных указанных пептидовН - А 1 а - .уз - 5 ег - У п,-Н (СЯ) Н - 5 дг -уз - 5 аг - У и -Н(СН ). П р и м е р Ч 1. Используя методыописанные в примерахи 1 но замещая И-концевые остатки зланийа и се" рина этильными группами, на заключительном этапе пептидного синтеза вместо защищенных аланина и сарколизина в реакцию сочетания вводят эквивалентные количества соответствующим образом защищенных й-Ы-этил-.-аланина или Й-с-этил-сарколизина, в результате чего получают следующие й-этилированные пептидыИСН- А 1 а - 1-уз - 5 ег - 01 п - ОЯ С Н аг - .уз - 5 аг - Ип - ОН.П р и м е р 1 Х, Открепление защищенных тетрапептидов, полученных в примере Ч 11 от смолы с использованием раствора аммиака в диметилформамиде в условиях, обычных для проведения реакции амидирования, с последующим9 980 б 15 10Продолжение табл, 3 удалением защитных групп приводит к получению амидов соответствующих й-этилированных пептидовСН- А 1 а - 1.уз - бег п - КН, С Н-. Баг - 1.уз - Ьаг - 61 и - ЙН 22П р и и е р Х. Защищенные ацетилированные тетрапептидные смолы, полученные в примере Ч, подвергают обработке раствором аммиака в диметилформамиде в условиях, обычных для проведения реакций амидирования, и после удаления защитных групп получают следующие амиды пептидовСНСО- Аа - .уь - 5 ег - 61 п - МН СН СО - айаг - .уз - Ьаг - 61 п - ЙНэП р и м е р ы Х 1-ХХЧ. При использовании совокупности реакций и методов, описанных выше, для удлинения пептидной цепи, получены следующие полипептиды, замещенные по, концевым амико- и карбоксильным группам радикалами Р иР- А 1 а - уз - ег - 61 п - Ргде Р и Р обозначают заместители при аминокислотных остатках, приведенные в табл. 3. те е61 у Н ХЧ 61 уу ХЧ Н 61 уу-бег ХЧ ХЧ ХЧ 115ХХ С 1 п 61 у" 6 у61 п 61 уу"5 ег ХХ Ьаг 61 у Ваг 61 уч Ж ХХ 1 ХХ 1 3 аг 61 уу-Ьег ХХ 1125ХХЧ Таблица 3 Анализируя полученные пептидныепродукты методами тонкослойной хрома тографии и электрофореза, при исполь"зованиисоответствующих методик, описанных к примередля соединений,описанных в примерах Х 1 и Х 11,Полученные результаты представле" з 5 ны в табл. 4 Табл мер лектрофорезиграция поапрвлениюкатоду, см а старте 0,303 4 а ста На старте На сарте 0,18 8,3 яптидов о формупособ полормулы- Ьег,Р-Н, СНР - ОН, й ете тон- офо,щей5 где чения поли 111чены3 и -Р,О.А 1 а; а, 2 МеАа.-А 1 а,Заг, ОСО,Ня,г ю Используя методики проведенкослойной хроматографии и элекреза, описанные в примерах 11для соединения примера ХХ пофследующие характеристики: Р=ОК 0,25, электрофоретическаяцйя (перемещение ) по направленкатоду = 0,88. Н 61 уу"бег"Авп61 п 61 у Ьаг 61 уу-бег-Азп 61 п 61 у"61 у-бег-АзпСоставитель В. ВолковаФРедактор М. Товтин Техред М.Коштура Корректор Н. Король Заказ 9395/50 Тираж 445 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по .делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 11 980615 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что замещенный по аминогруппе 1 -глутамин присоединяют к нерастворимой полимерной смоле ковалентной связью предпочтительно в среде абсолютного этанола при +80 С, удаляют а-аминозащитную группу от 1.-глутамина обработкой про.дукта присоединения аминокислота-полимерная смола трифторуксусной кислотой, деблокированную аминогруппу - 1 О глутамина подвергают взаимодействию с У-аминокислотой, защищенной по с- аминогруппе, используя предпочтительно карбодиимидный метод, после удаления с-аминозащитной группы обработкой 5 трифторуксусной кислотой, продукт вводят во взаимодействие с 1."лизином, защищенным по об-аминогруппе, предпочтительно используя карбодиимидный метод, полученную защищенную по о"аминов группе трипептид-полимерную смолу деблокируют обработкой трифторуксусной кислотой и трипептид-полимерную смолу конденсируют с М-К-замещенной Х- аминокислотой, защищенной по ее о-аминогруппе, предпочтительно используякарбодиимидный метод; обработкой полученного продукта кислотой, если кОН, или аммиаком в диметилформамиде,если В - МН, отщепляют пептидную цепьот смолы и деблокируют защищенный пептид обработкой трифторуксусной кисло-той и в случае использования бензгидриламиновой смолыВ - ЙН) независимо от обработки продукта кислотой илиаммиаком,2. Способ по и. 1, отличающ и й с я тем, что в качестве. полимерной смолы используют хлорметилированный полистирол дивинилбенэола и бензгидриламиновую смолу.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Шредер Э., Любке К.Пептиды. Ч, 1,М "Мир", 196, с 398.2. Ног 11 с 1 К., 1 дапо К., попуе К.ЗутйЬеэ 1 э о 1 Ье Мегг 1 Г 1 е 1 д Веэ 1 п еэ 1 егз о Й-ргойес 1 ед ая 1 по асдэ и 1 ЮЬе а 10 оГ Нудгодеп Ьоцд 1 пд. СЬев.1.еййегэ, 1978, с. 165.