Штамм гриба trichoderma reesei продуцент целлюлолитических ферментов

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1К ПАТЕНТУ Комитет Российской Федерации до датентам и товарным знакам(46 30.1093 Бюл Мв 39-40РЗ) Синицын Аркадий Пантелеймонович(54 ШТАММ ГРИБА (ТВСНООЕВМА ВЕЕЗЕ 1- ПРОДУЦЕНТ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ(5 Т) Иатользование; в мищэобиологической промышленности и касается нового штамма- -продуцепа внеклеточных цеппюпаз, используемых в пищт щщщщщщщщн щщящ щщ щщщдля экстракции раститепьйых внутриклеточных веществ дпя силосования кормоа Сущность изобретенитс получен штамм-продуцент с повышеннойпродуктивностью, позволяющий при одностадийнойферментации обеспечить высокую активность фермента в ферментационной среде при высоком выходе фермента с единицы массы использованногосубстрата Мутант ТпсЬодептта геенна ВСМ 182/КК(19) КЯ (1 ц 2991949 Х 1 (51) И 1 14 СП 1 Ч 9 4 Х процессов из исходной культуры Т,геею азу 43803. Мезофипен, Оптимальная температура роста мицелия 32 фС, оптимум образования целлюлозы 28 ОС. Штамм имеет ферментные системы позволяющие расти на целлюлозе, крахмале, хитине, пектине, ксипане, ламинарине, пихенине. Способен утилизировать молочную кислоту. Катвболитная репрессия биосинтеэа целлюпаэ практически отсутствует. При росте на среде, содержащей 196 аморфной целлюлозц относительная активность целлюлаэ не изменяется при внесении в среду до 5% глюкозы или 596 глицерина При культивировании на жидкой питательной среде на основе саекповичного жома достигается уровень активности в 3,5 - 42 ед/мл ГРА (время культивирования 110 ч), при культивировании на лактозе - 182 ед/мп (81 ч), при культивировании на концентрированной молочной сыворотке - 12 - 14 ед, мп (100 - 110 ч). 2 табл10 15 20 мав грибов, субстратами, используемыми для ферментации, и условиями проведения процесса. Стоимость полученных ферментов главным образам определяется уровнем активности целлюлаз в ферментационной - еде карастью (поадуктивнастъю) обра"оваии ферментов, выходом ферментов с един 1;,ы массы использованного с бстрата, с мс ью субстрата.Оелмы грибов рада Тг 1 сЬадегва явля.,1 сл наиболее активными продуцентами цел . алаэ. цельн. 1 лавышения их способности к лрадукц и целл олаз и адаптации к Салее,лешев: м средам были получены различи;е мутанты Т.геезе 1, Например, в авт. св. СССР М 591502 и М 745933 описаны штаммы Тг 1 сЬа 1 беппа ч 1 г 1 бе "Б" и "44", ;1 рядн азначенн ые преимущественно для куг,ьтивирааания на средах на основе свеклаьиичнага жома В патенте США 1 ч 4472504 писана получение целлюлаз мутантом Т.геезе 1 МСО 80, который получен из мутанта Т.геене ВцтСЗО, При использовании питательнай среды с 8 6-най целлюлозой и,лабавлсноем биатина при непрерывной ф" регента,ии достигается активность цел алаз 17 ед/мл ГРА (здесь и далее пб екс.: "1 А" - актичасть целлюлазного 50 амплекса, определенная по фильтровальчай бума; е и еыреженная в международных еиницак согласна рекомендациям 1 ОРАС: Т 1;.СИазе., Рцге апа Арр 1, СЬеа., чо 1.59,1 а.2 ар. 257 - 268), что соответствует вы аду 21 ед г РА на 1 г целлюлаэы.,1-л.-;ь мутэн 1 ы Т.геезе 1, катарые г:ри использовании в качестве источника углерода глюкозы образуют целлюлвзы, С по-ощьо л;у 1 анта Т.геезе 1 ЧТТ-79125 на чИзобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма продуцента внеклеточных целлюлаэ и других ферментов, лиэирующих клеточную стенку. Получаемые целлюлазы и/или мультиферментные комплексы могутбыть использованы для биодеградации целлюлоза- и гемицеллюлоэосодержащих субстратов, в том числе отходов промышленности и сельского хозяйства, для биодеградации живых и мертвых клеточных стенок растений, использоваться в качестве добавок в кормах, а также в пищевой промышленности, спиртовой промышленности и пивовэрении, для экстракции растительных внутриклеточных веществ, для силосования кормов в сельском хозяйстве.Известны штаммы - продуценты целлюлаз и способы их аэробного культивирования.Известные способы различаются главным образам видами применяемых штам 25 30 35 40 45 питательной среде, содержащей 4 глюкозы и 4 твердого остатка зерна после этэноль ной ферментации, достигалась целлюлаэная активность 6,4 ед/мл РРА, Если вместо глюкозы применялась целлюлоза, то достигалась примерно та же активность целлюлаэ (Материалы 3-го Европейского конгресса по биотехнологии, Мюнхен, ФРГ, 10 - 14.09.84: М.Ва 1 з. СеИцазе ргоОцс 1 оп Ьу Ммапс зга 1 пз оФ Тгсйобегаа геезе оп поп-сеИцозс веб 1 э),Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является мутант Т.геезе 1 1 МЕТ 43803 (патент ГДР 00 291673), который обеспечивает высокую продуктивность по целлюлаэам и высокий (до 10 ед/мл РРА при культивировании на лактозе) уровень активности целлюлаэы вследствие частичного уменьшения катэболитной репрессии биосинтеэа ферментов.Этот штамм характеризуется следующими признаками. Культивируется типичным для всех штаммов Тгсйобегвв образом (например, нэ картофельно-декстроэном агаре или на агвре споруляции), Агар Чапека-Доукса не подходит, т,к. использование нитратов как источника азота данным штаммом не осуществляется, Температурный оптимум куль 1 эиргьания 28-30 С, время культивирования 5-6 сут. плюс 5-7 сут при комнатной температуре до полного развития штамма,1 ересееают с помощью конидий, цвет кочидий:,еленый, изначально желто-эегенй При .;ультивировании на картофельно-декстроэном агаре после 5-6 сут роста диаметр колонии 70-80 мм. Колонии рыхлые, концентрические,Мутант является прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лэктоэу, глицерин, ксилоэу, Фруктоэу в комбинации с аморфной цел: юлоэай.Целью изобретения является получение высокоактивного дереп рессированного штамма - продуцента целлюлаэ, пригодного для культивирования на дешевом сыще в присутствии высоких концентраций сахаров, в том числе на молочной сыворотке, и обеснечивающего высокие уровень активности целлюлэз в фсрментационной среде и выход ферментов с единицы массы ис. польза ванного субстрата.Сущность изобретения заключается в том, что для достижения поставленной цели получен мутант с повышенной продуктивностью, паз чляющий при адностадийной ферен 1 ациь обеспечить высокую активность фермента е ферментацианной среде при высоком выходе фермента с единицы массы использованного субстрата. При этом в процессе Ферментации скорость абразова 200194910 15 20 25 30 35 ния ферментов сохраняется постоянной и высокой, а для культивирования мутанта используются дешевые субстраты,Мутант Т,гееэе ВСМ 18.2/КК получен с помощью парасексуальных процессов иэ исходной культуры Т.гееэе 1 МЕТ 43803. В результате трехступенчатой селекции с последующим отбором клонов,Мицелий септирован и сильно раэветвлен, формируются после 30-32 ч роста в виде боковых ответвлений гиф,На комплексных средах агара (картофельно-декстрозный агар, агар для споруляции. СМ-агар) колонии растут быстро, До начала споруляции (2 сут.) колонии белые (прозрачные), плоские, с гладкой поверхностью, В дальнейшем образование конидий(фиалоспор) происходит после слабого индуцирования видимым светом, и на 3 сут колония приобретает зеленоватую окраску. Образование воздушного(объемного) мицелия не наблюдается.СМ-агар. Через 5 - б сут роста при 30 С диаметр колоний около 40 мм, колонии достаточно плотные, компактные, концентрические. с неровными краями, наблюдается выделение в среду желтого пигмента. Прорастание на всю поверхность чашки Петри не происходит, Картофельно-декстрозный агар. На 5-6 сут роста диаметр колонии 70 - 80 мм, Колонии более рыхлые, конценгрические, неровность краев менее выражена. Наблюдается слабое выделение желтого пигмента в среду. Через 10 - 12 сут. роста колония занимает всю поверхность чашки Петри. Минимальная среда с 2 глюкозы или 2 6 фруктозы, или 20 глицерина. Слой мицелия существенно тоньше. чем на картофельном агаре, диаметр колоний 70 - 80 мм, 40 конидии образуются через 4 сут роста, споруляция слабая. выделение пигмента не наблюдается. Через 10 - 12 сут, роста колония занимает всю поверхносгь чашки Петри.Минимальная среда с 1%-ной аморф ной целлюлазой. Мицелий тоньше, более рыхлый, пигмент в среду не выделяется. Через 4 сут. роста диаметр колоний 70 - 80 мм.При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых суб стратов (глюкоза, фруктоэа, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий без пеллетиэации, удельная начальная скорость роста мицелия составляет 0,3 ч , в конце культивирования 0,1 ч, 55Эизиолого-биохимические признаки.Меэофилен, Оптимальная температура роста мицелия 32 С (30-34 С), оптимум для обраэовачия целлюлазы 28 С(26-30 С). Оптимальный рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но образование целлюлаэ не происходит.Реэистенция к нистатину слабая. При повер;,ностном культивировании устойчив до концентраций 0,5 мкг/мл, при концентрации 2 мкг/мл рост полностью подавляется. При добавлении в среду дигитонина (4 мкг/мл) или бенгальского розового (30 - 50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.Является прототрофом. Способен ассимилировать глюкозу, лактозу, глицерин, галактозу, ксилоэу, О-маннит, маннозу, трегаллоэу, - и О-арабинозу. сорбозу, сорбит, 2-деэокси-О.-глюкозу (в присутствии глюкозы), рибоэу, деэоксирибозу (в присутствии глюкозы), 5-тио-О-глюкозу (в присутствии глюкозы и 2-дезокси-О-глюкозы),Не ассимилирует: 1-рамноэу, О-глюкозамин, 2-дезокси-О-глюкозу, дезоксирибозу, дезоксигалактоэу, 5-тио-О-глюкозу,Использует аммонийную и белковую формы азота, не использует нитратную форму.Имеет соответствующие ферментные системы, позволяющие расти на целлюлозе, крахмале, хитине, ксилане, ламинарине, лихенине. Способен разжижать желатину. Способен утилизировать молочную кислоту (быстрее, чем лактоэу) при концентрацияхниже ингибирующих.Катаболитная репрессия биосинтеза целлюлаз практически отсутствует, Проверка катаболитной репрессии биосинтеэа целлюлаз заключается в следующем.Конидии пересеваются в пробирку с минимальной средой, содержащей аморфную целлюлозу и исследуемый репрессор или антиметаболит. Диаметр пробирки - 9 мм, высота столбика агара 50-60 мм. Пробирка инкубируется 96 ч при 30 С и 20 ч при 45 С. Мерой уровня биосинтеэа целлюлаэы является глубина расщепления целлюлазы в пробирке.Табл. 1 показывает действие антиметаболитов и легко утилизируемых субстратов на образование целлюлаз.Тг спобеггпа гееэе 1 ВСМ 18.2/КК культивируется в аэробных условиях методом глубинной ферментвции в питательной среде, содержащей один или несколько субстратов - индукторов биосинтеза целлюлаз и/или образования ферментов, лизирующих клеточную стенку, Задача может достигаться и в случае наличия в питательной среде субстратов, не являющихся индукторами. Мутант способен при подходящем проведении процесса на основе использования растворимых субстратов, например глюкозы илиП р и м е р 1. Культивирование осуществляют на жидкой питательной среде следу Ющвго СОСтаеа: 40 Г/Л СВЕКЛОВИЧНОГО жОМЭ;14 г/л солодовых ростков; 6 г/л (йН 4)2804 2 г/л КН 2 Р 04; 0,6 г/л М 98047 Н 20; водо проводная вода рН 5,4.Засев ферментационной среды осущвст вляют водной суспенэией конидий культуры, выращенной на картофельно-декстрозном агаре из расчета 10 конидий на 100 мл среды.Процесс ферментации проводят в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл при обь еме среды 100 мл на качалке при 30 С и 200 Об/мин.Через 110 ч культивирования уровень активности составляет 3,5-4,2 ед/мл по фил ьтровальной бумаге. 45П р и м е р 2. Культивирование осуществляют на жидкой питательной среде следующего состава:20,0 г/л молочного сахара (96 лвктозы); 3,0 г/л КН 2 РОд; 4,8 г/л (йН 4)2804 0,4 50 лактоэы, выделять в культуральную среду полный ферментный комплекс целлюлаэ.Характерным и отличительным признаком штамма является состав внеклеточных белков, определяемый поданным изоэлектрофокусирования в поливкрилэмидном геле в диапазоне рН 3,0-10,0 (готовая пластина фирмы "Серва", ФРГ, краситель - Кумассси 6-250), табл. 2.Примеры использования атвммв Тг 1 сЬобеппа геезе ВСМ 18,2/КК для получения целлюлолитических ферментов.Для получения исходного посевного материала культуру штамма выращивают нв картофельно-декстрозном вгаре при 30 С в течение 6-8 сут.Приготовление исходного посевного материала возможно и нв сыпучей среде следующего состава. г:Свекловичный жом 190Солодовые ростки 150Пшеничные отруби 410Водопроводная вода 750В каждую иэ колб обьемом 750 мм вносят 25-30 г указанной среды и культивируют при 30 С в течение 5-6 сут беэ перемешивания. г/л М 9804 х 7 Н 20; 0.4 г/л СаС 12; 30 г/л экстракта пшеничных отрубей (3); 4,0 г/л целлюлазы микрокристаллической; 5 мг/л Ре 804 х 7 Н 20; 1,6 мг/л М 9804 х 7 Н 20;1,4 мг/л Еп 804 х 7 Н 20; 2,0 мг/л СО 804 х 7 Н 20.Начальное значение рН 5,45.Процесс ферментации проводят в ферментере обьемом 200 л при 30 С, Рабочий обьем ферментера в начале ферментации 110 л, к 81 ч 150 л. Режим ферментации - дробное добавление лактозы; начальная концентрация лактоэы 20 г/л, после утилизации лактозы на начальной фазе ферментации (после 24 ч) уровень лактоэы контролируется автоматически и поддерживается постоянным на уровне 1 - 3. Общий расход лактозы за время ферментации (81 ч) составляет 44,8 л раствора концентрацией 20,Уровень активности составляет 18,2 ед/мл ЕРА при времени культивирования 81 ч. Это соответствует выходу 245 ед. РРА с 1 г лактозы.П р и м е р 3. Культивирование осуществляют на среде и условиях, аналогичных описанным в примере 2, однако вместо раствора лактозы используют концентрированную молочнуо сыворотку с содержанием лактозы на уровн . 20 ф и с предварительно отделенными бе". ми сыворотки путем нагрева и коагуляцдь или путем ультрафильтрации.Уровень акт явности зависит от концентрации молочной кислоты в сыворотке и составляет 10-14 ед/мл п.ри времени культивирования 100 - 110 ч,5 10 15 20 25(56) Авторское свидетельство СССР В 591502, кл, С 12 й 9/42, 1978.Патент СОА Ч. 4472504, кл. С 12 й 9/42, опублик. 1984,М.Ва 11 а, Се.о 1 азе ргобосбоп Ьу Мотап з(го 1 пз о 1 ТгсЬОЬегва геезе 1 оп попсеИо 1 оз 1 с МеЬ 1 а.Материалы 3-го Ееропейского конгресса по биотехнологии Мюнхен. ФРГ, 10- 14.09.84,Патент ГДР М 291673, кл. С 12 й 9/42, опублик, 1991.10 2001949 Таблица 1 Репрессия образования целлюлаэ субстратами/антиметаболитами: относительная активность целлюлаэ (в мм расщепленной целлюлозы при росте на 1 ф-ной аморфной целлюлозеН,Р.-нет расщепления. Таблица 2 Спектр характеристических внеклеточных белков Тгсйобегва гееэе 1 ВСМ 18.2/КК при культивировании на лактозе в условиях примера 2.,Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035. Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Формула изобретения Штамм гриба ТгсЬодеггпа геезе ВГНКИ 28-продуцент целлюлолитических ферментов.