Способ получения модифицированных аллергенов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИКГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)п 2 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ етельству к авторском(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АЛЛЕРГЕНОВ(57) Изобретение относится к иммунобиотехнологии, а именно к способу получения модифицированных аллергенов. Цепь изобретения - снижение(51) 6 А 61 К 39 35 47 48 аплергенности иммуногенов Сущность изобретения: способ заключается в том, что проводят конъюгацию аллергена с сопопимером й - винилпирропидона и малеинового ангидрида мол м 30 - 70 КДа Модифицированным элсилонаминокапроновой кислотой и активированным М - оксисукцинимидом при массовом соотношении аллерген. полимер от 2 5 до 3: 2 Положительный эффект. в полученных новых полимер - белковых конъюгатах исходный белок теряет выраженные свойства индуцировать 1 дЕ антителообразование при сохранении способности к индукции антител класса 1 дб Изобретение позволяет снизить аплергенность иммуногенов 2 табл.Изобретение относится к иммунобиологии, а именно к способу получения новых полимер-белковых конъюгатов, где исходный белок теряет изначально ясно выраженные свойства индуцировать 9 Е антителообразование. Полученный конъюгат при иммунизации мышей не вызывает образования 19 Е антител к нативному белку (немодифицированному) при сохраненной способности индуцировать 90 антителообразование. Предлагаемый конъюгат может найти применение при иммунотерапии аллергических заболеваний.Цель изобретения - снижение аллергенности иммуногенов путем понижения способности аллергена индуцировать антитела класса 19 Е при сохранении к индукции антител класса 196.Это достигается способом получения модифицированного аллергена, отличием которого является то, что аллерген конъюгируют с сополимером М-винилпирролидона и малеинового ангидрида ср. мол,м, 30 - 70 КДа, модифицированного эпсилонаминокапроновой кислотой и активированного Гчоксикукцинимидом, при рН 7,5-9,5 и массовом соотношении аллергена и модифицированного активированного сополимера, находящемся в интервале от 2:5 до 3:2,Конъюгаты с модифицированным активированным сополимером, имеющим ср. мол,м, ниже 30 КДа, индуцировали низкие титры антител классов как 19 Е, так и 190. Конъюгаты с модифицированным активированным сополимером, имеющим ср, мол.м. выше 70 КДа индуцировали низкие титры антител класса 19 Е, Использование соотношения аллерген; активированный сополимер ниже 2:5 снижает выход конъюгата, при соотношении аллерген: активированный сополимер выше 3:2 значительная часть аллергена не вступает в реакцию, и выход конъюгата на аллерген ниже,Конъюгацию аллергена овальбумина (ОА) проводят линейным сополимером й-винилпирролидона и малеинового ангидрида (ВМА), модифицированного е-аминокапроновой кислотой (АКК), в качестве спейсера, При такой обработке иммуногенные свойства аллергена сохраняются или усиливаются (индукция 196-антител), а аллергены и индукция 19 Е-антител - снижаются или вообще блокируются. Конъюгация ОА ВМА в отсутствии спейсера, а также простая смесь ВМА или ВМА-АКК с ОА не дает нужного эффекта.Исходный ВМА получают методом радикальной сополимериэации в присутствии динитрила азо-бис-изомасляной кислоты.5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Молекулярную массу оценивают по значению характеристической вязкости, Состав полимера определяют методом ЯМР-спектроскопии и потенциометрического титрования. Средневязкостная молекулярная масса ВМА, используемого для данной цели, составляетт 30-70 КДа, Гидролизова н н ы й В МА не обладает токсичностью на мышах при введении 500 мг/кг веса.Модификация ВМА АКК осуществляется методом, описанным ранее, и карбоксильные группы в полученном ВМА - АКК активировались с помощью трифторацетоксисукцинимида для последующего присоединения ОА.Конъюгирование ОА с активированным ВМА-АКК осуществляется в водной среде при рН 7,5-9,5. при соотношении полимер: ОА = 2;5 - 3;2, процесс ведут при температуре 4-20 С, П р оду кт реа к ци и в ы дел я ют с помощью ультрафильтрации и анализируют высокоэффективной гель-хроматографией. Его состав определяют аминокислотным анализом и УФ-спектрофотометрией.Сополимер Й-винилпирролидона и малеиновога ангидрида (ВМА) производства Института элементоорганических соединений АН СССР (ВТУ 23-86) с ср.мол.м. 30-70 КДа, приведенная вязкость - 0,11 дл/г.П р и м е р 1, Сополимер М-винилпирролидона и малеинового ангидрида, модифицированный эпсилонаминокапроновой кислотой (ВПМА-АКК).6,86 г эпсилонаминокапроновой кислоты суспендировали в 50 мл диметилформамида (ДМФ), добавляли 12,76 мл (52,3 ммоль) М,О-бистриметилсилилацетамида, перемешивали до получения прозрачного раствора и добавляли 5,1 г (26,15 ммоль ангидридн ы х груп и) В МА. Реа кцион ную смесь перемешивали в течение суток при 20 С и полученный раствор выливали в 500 мл изопропанола, Осадок отфильтровывали, промывали изопропанолом, растворяли в 100 мл воды проводили диафильтрацию на мембране УМ(Ащсоп). Концентрат высушивали лиофильно. Выход 5,38 г, содержание эпсилонаминокапроновой кислоты по данным аминокислотного анализа (Во 1 гопсС 5001) - 2,7 ммоль/г.П р и м е р 2, М-оксисукцинимидный эфир В МА - АКК (В МА - АКК - ОС).К суспензии 0,9 г полимера, содержащего 2,7 ммоль эпсилонаминокапроновой кислоты, и 0,9 мл пиридина в 20 мл диметилформамида прибавляли 1,53 г (7,25 ммоль) трифторацетоксисукцинимида, Полученный через 5 мин прозрачный раствор выдерживали 1 ч при 20 С и реакционную массу выливали в 300 мл изопропанола.Осадок отфильтровывали, промывали гексаном и высушивали в вакууме. Выход 1,13 г (97,5 ). ИК-спектр в ваэелиновом масле, 1/см; 1805, 1755, 1730, 1680, 1540 и 1205. Содержание М-оксисукцинимидных групп, определенное спектрофотометрией при 260 нм, полученного продукта в 0,1 М растворе аммиака составляло 1,99 ммоль/г.П р и м е р 3. Получение смеси ОА и ВМА - АКК.Смесь 50 мг ОА и 50 мг ВМА - АКК (соотношение 1:1) растворяют в 5 мя дист. воды при рН 7 и раствор высушивают лиофильно. Выход составляет 104 мг, Содержание ОА - 49 .П р и м е р 4. Конъюгат ОА с ВМА (конъюгат 1).К раствору 200 мг ВМА в 1 мл ДМФ прибавляли 200 мг ОА (соотношение 1:1) в 7 мл 0,2 М раствора МагНРО 4, перемешивали в течение суток. Раствор фильтровали через мембрану ХМи концентрат лиофилиэовывали. Выход - 480 мг, содержание ОА - 22.П р и м е р 5. Коньюгат яичного альбу- мина (ОА) с ВМА - АКК - ОС (коньюгат р и н).В раствор 200 мг ОА ("Яегча") в 5 мл 0,2 М Ма 2 НРО 4 (рН 9,5) добавляют 500 мг ВМА - АКК-ОС (соотношение 2:5) и полученную суспензию перемешивают до полного растворения в течение суток при 4 С, Затем в раствор вводят 100 мкл конц. водного аммиака, перемешивают 1 ч, подкисляют до рН 5 и фильтруют. Фильтрат подвергают диафильтрации через мембрану с порами 100 КД (ХМ - 100. Авсоп) для обесеоливания и удаления свободного ОА (М = 45 КД), Образовавшийся в процессе ультрафильтрации осадок отфильтровывают, Фильтрат высушивают лиофильно: выход конъюгата р - 103 мг, содержание ОА - 14 мас,;6. Набухший осадок с фильтра промывают дист. водой, суспендируют в воде и лиофилизуют. Выход конъюгата н - 392 г, содержание ОА - 23 мас. .П р и м е р 6. Конъюгат ОА с ВМА-АКК - ОС (конъюгат ),Смесь 100 мг ВМА-АКК-ОС и 150 мг ОА (соотношение 3:2) в 8 мл 0,2 М фосфатного буфера с рН 8,1 перемешивали до растворения в течение суток. Раствор фильтровали через мембрану ХМ - 100 и концентрат лиофилизовывали. Выход 201 мг, содержание ОА - 25 ЯП р и м е р 7, Конъюгат ОА с ВМА - АКК - ОС (конъюгат У),К раствору 50 мг ОА в 2 мл дист. воды добавляют 40 мкл М-метилморфолина (рН 7,5), 64 мг ВМА - ЛКК-ОС (соотношение 5:6) и перемешивают до образования растворав течение суток. Затем добавляют 20 мклконц. водного аммиака, диафильтруют намембране ХМ - 100 и концентрат лиофилизу 5 ют. Выход - 7 мг с содержанием ОА - 28масП р и м е р 8. Исследование биологических свойств конъюгата У не показало существенных отличий от свойств конъюгата1 0 ,Для изучения иммуногенности конъюгатов ОА с ВМА - АКК использовали мышейсамцов (СВА х С 57 В/6)Г гибридов весом18 - 20 г, полученных из питомника АМН15 СССР "Столбовая", Животных иммунизировали трижды с интервалом 3 недели внутрибрюшинно в дозах по 0,5, 10 и 100мкг/мышь. Для получения сыворотки заборкрови осуществляли из ретроорбитального20 синуса на 10 день первичной иммунизациии в первую и третью недели вторичной итретичной иммунизации соответственно.Исследование гуморального антительного ответа к ОА для определения гомоци 25 тотропных дЕ и суммарных 90 антител кОА проводили с использованием методовпассивной кожной анафилаксии (ПКА) итвердофаэного иммуноферментного анализа(ИФА), Реакцию ПКА проводили с пулиро 30 ванными сыворотками мышей различныхгрупп, а ИФА проводили с индивидуальными сыворотками от каждой группы.В доступной литературе, посвященнойконьюгатам данного сополимера, не отме 35 чалось свойства редуцировать индукциюдЕ антител при введении в организм, Действительно конъюгат немодифицированного сополимера с ОА индуцируют дЕантителообразования в той же степени, что40 и нативный ОА. Существенное подавлениепродукции 9 Е наблюдается только при использовании сополимера модифицированного зпсилонаминокапроновой кислотой.Вместе с тем, способность белка индуциро 45 вать дб антитела не только сохраняется, нодаже усиливается при использовании высокой дозы (100 мкг).Результаты биологических испытанийновых конъюгатов приведены в табл,1-2,50 Как видно из представленных данных, уровни дЕ антител к ОА при введении ОА удается зарегистрировать спустя неделю послевторичной иммунизации дозами по 0,5 и 10мкг; доза в 100 мкг почти не вызывает обра 55 эования 9 Е, что соответствует общепринятым представлениям. Четко выраженныйд Е ответ к ОА 1 нед, после третичной иммунизации удается зарегистрировать при всехтрех дозах ОА, а через 3 нед. он сохраняетсятолько для дозы 0,5 мкг (табл,1). Там жес,"1824738 Накопление 1 дб антител к ОА, индуцированных препаратом 11 р, имело сходную динамику с таковой, при накоплении 1 дО антител к ОА при иммунизации ОА. Таблица 1 25 Уровни анти-ОА иммуноглобулинов класса Е в реакции пассивной кожной анафилаксии после иммунизации мышей на О, 21 и 42 дни различными препаратами в уравненных по ОА дозахПродолжение табл, 1 представлены данные по образованию 1 дЕ антител для конъюгатов ОА с модифицированными сополимерами винилпирролидона и малеинового ангидрида. Способность к индукции 1 дЕ антител у последних значительно снижена - только после третьей иммунизации выявляются 1 дЕ антитела на дозы 10 и 100 мкг. Тогда как более эффективная доза - 0,5 мкг не вызывала 1 дЕ антителообразования, Препарат 111 не индуцировал 1 дЕ антитела при всех исследованных дозах в течение всех сроков наблюдения, Что касается суммарных антител 1 дб класса к ОА (табл.2), то наблюдалось дозозависимое усиление вторичного и третичного антителообраэования при введении препаратов 11 н и 111 по сравнению с контролем (введение ОА),Иммунизация мышей конъюгатом ОА снемодифицированным сополимером (1) или смесью ОА и модифицированного сополимера не давало эффекта угнетения образо вания 1 дЕ (табл.1), и продукция 1 дО быласходна с таковой в случае иммунизации только ОА (табл.2).Таким обрззом, при иммунизации полимер-аллергенными конъюгатами ОА и мо дифицированного сополимера обнаруженоих новое свойство не индуцировать образование 1 дЕ антител к присоединенному аллергену (белку) при сохранении (или даже усилении) способности индуцировать обра зование 1 дб антител. Это новое свойствооткрывает путь к созданию новых терапевтических препаратов, направленно подавляющих аллергическую реакцию к определенным распространенным аллерге нам. Кроме того, возможно использованиеэтого свойства для снижения аллергенности вакционных препаратов без подавления индукции протективных антител.10 1824738 Продолжение табл. 1 Таб лица 2 Уровни анти-ОА иммуноглобулинов класса О, определенные методом Е ЯА, после иммунизации мышей на О, 21 и 42 дни различными препаратами в уравненных по ОА дозах,Результаты приведены с доверительными интервалами в единицах оптической плотнос 1 и при длине волны 450 нм, Величина оптической плотности при 450 нм и доверительный интервал при 0.05Дни забора крови конъюгатОА 100 10 0,5 0,5 мкг 10мкг 100 мкг мкг мкг мкг Продолжение табл. 2 Величина оптической плотности при 450 нм и доверительный интервал при 0,05Дни забора крови смесь ОА и ВМА-АКК конъюгатн 10 100 мкг 0,5 мкг 10мкг 100 мкг 0,5 мкг мкг 10 дн,20 дн. 42 дн. 49 дн.56 дн,10 дн,20 дн, 42 дн, 49 дн. 56 дн. 0,212 0,016 0,2061824738 12 Продолжение табл. 2 Величина оптической плотности при 450 нм и доверительный интервал при 0,05Дни забора крови коньюгат И конъюгат И 10мкг 0,5 мкг 100 0,5 10мкг 100 мкг мкг мкг 0,206+0.054 Формула изобретенияСПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АЛЛЕРГЕНОВ путем их коньюгации с полимером, отличающийся тем, что. с целью снижения аллергенности иммуногенов, в качестве полимера используют сополимер Й - винилпирролидона и малеинового ангидрида мол.м, 30 - 70 КДа. модифицированный эпсилонаминокапроновой кислотой и активи рованный Й - оксисукцинимидом, приэтом коньюгацию проводят при массовом соотношении полимер-аллерген (5 2)-(2: 3),Составитель С,АндреевТехред М.Моргентал Редактор З.Ходакова Корректор Н,Бобкова Заказ 272 Тираж Подписное НПО "Поиск" Роспатента113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 10 дн.20 дн.42 дн.49 дн.56 дн. 0,1820,0250,228