Способ получения экзотоксинсодержащего препарата из раствора

(2 1) 4 (22) 1 (46) 0 (71) В льзование; биотехнология, произзотоксинсодержащих препаратов, изобретения; культивируют продуоксина ВасИ 1 в Фцг пцепв з затем ьную жидкость фильтруют для удаатков питательной среды и конценния ее с помощью ьтрационных мембран с различны- рами пор 5000 - 10000 Да, затем в те устанавливают рН 4,5-5,5,0 упасодержания сухих веществ 2,4-4,8 арно проводят ультрафильтрацию мембранах. 10 табл. исследовательскийкробиологииУсачев. ф. Ш. Исан 3, Короткая8, кл. С 12 М 1/00,нсти72) А алин 56) А 980. Тллин. ТУ - 64 ция, что приводит Использование ги няет способ и веде препарата за счетЦелью настоящ ся снижение себе препарата.Поставленная ель достигается е в воде остатк исутствующие в высокомолекул тся с помощью ральной жидко рами пор по пр кулярным весом и пита- раствоярные ультраоримь ипр янии даляю культу разме моле сти на пуска- (5000 рата доводят до 4,5- центрации экзотокс павший осадок о цией на мембранах,5, упна (2,4деляю рива ют 4,8) г ультраф сновными саждние эзм ОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО СССРГОСПАТЕНТ ГССР)1ОПИСАНИЕ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 51765/13 10.89,02.93. Бюл, М 5 есоюзный научн ут прикладной м А. Соломин, Н, А В, А, Чугунов и Г т, свид, М 8538 на Витоксибаци 87.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКЗОТОКСИНСОДЕРЖАЩЕГО ПРЕПАРАТА ИЗ РАСТВОРА тение относится к области биои может быть использовано при ве экзотоксинсодержащих биопрепаратов -" средств защиты Изобретехнологиипроизводстлогическихрастений,Произвтоксинсодесибацилли0,2 - 0,4 вес,мопатогеннповышенияспособ, вссталлическнойсреды о(фильтрациосадок гидляется цени высушиваТакой одимые в настоящее время экзоржащие препараты типа битокна характеризуются низким % содержанием основного энтоого агента - экзотоксина. Для его содержания был предложен оответствии с которым спорокриий комплекс и остатки питательтделяются центрифугированием ей), зкзотоксин переводится в роксидом кальция, осадок отдетрифугированием (фильтрацией) ется.способ имеет ряд недостатков, из которых являются неполное экзотоксина гидроксидом каль(57) Испо водство эк Сущность цент экзот культура л ления ост трирова ультрафил ми разме концентра ривают до г/л и повт на тех же что,- нераствтельной средьримом состосоединения уфильтрациимембранах снию белков с10000) Да;- рН фильдо конл и выильтра к его потере более 50 %, дроксида кальция усложт к увеличению стоимости технологических затрат. его изобретения являет- стоимости единицы веса28 - 30 С ром пор по пропусканию белков с молекулярным весом (5000 - 10000) Дэ,Сущностью данного способа является применение ультрафильтров с размером пор по пропусканию белков с молекуляр ным весом (5000 - 10000) Да, что дает возможность очистки экзотоксина от сопутствующих высокомолекулярных веществ с минимальными потерями.Способ заключается в том, что примене- "0 ние мембран с размером пор по пропусканию белков (5000 - 10000) Да позволяет повысить содержание зкзотоксина в препарате с минимальными потерями.Упэривание экзотоксина при рН 4,5 - 5,5 до концентрации экзотоксина (2,4 - 4,8) г/л позволяет очистить экзотоксин от балластных веществ, прошедших через мембрану (нуклеотиды, пептиды и т,п,), повторной ультрафильтрацией. 20П р и м е р 1, Культивирование микроорганизмов Вас. Фогп 91 епзз штамм 98 - 1 с проводили в ферментаторе объемом 8 л на дрожже-полисахаридной питательной среде (ДПС) следу 1 ощего состава, %;25дрожжи кормовые 3,0мука кукурузная 1,5синтетическийпеногаситель 0,08 при следующих условиях; 30температуракультивированилчастота вращениямешалки 200 - 300 об/минизбыточное давление 0,4 - 0,5 атм З 5расход воздуха 0,1 л/чСодержание сухих веществ в полученной культуральной жидкости (КЖ) составляло 2,8 г/л, рН КЖ (6,0-0,5) ед. рН, а содержание экзотоксинэ 0,43 г/л. 40После ферментации из КЖ удаляли остатки питательной среды методом тангенциальной фильтрации на ультрафильтрационных мембранах с различными размерами пор, в диапазоне (4500-0,1), Разделение проводили 45 в следующих условиях:скорость тангенциальногопотока (2,0-5,0) л/стемпература КЖ (25+-5) Странсмембранное 50давление (0,2+-0,02) М ПАПотери экзотоксина (г/л) и его содержание(г/кг) в сухом концентрате после ультра- фильтрации на мембранах с разными диаметрами пор показаны в табл, 1, 55Экзотоксин, выделенный в виде фильтрата, упаривали до его содержания в концентрате фильтрата 2,4-4,8 г/л при рН 4,5 - 5,5, что позволило очистить экзотоксин от балластных веществ, прошедших через мембрану (нуклеотиды, пептиды и т,п.), повторной ультрэфильтрацией.Данные представлены в табл. 2, где приведены потери экзотоксина (г/л) и его содержание (г/кг) в сухом концентрате послеочистки фильтрэта в зависимости от содержания экзотоксина в концентрате фильтрата (г/л),Выбор допустимого измерения рН раствора выбран на основании данных, представленных в табл, 3, где приведеносодержание (г/кг) экзотоксина в сухом концентрате после очистки фильтратэ в зависимости от его рН.Затем полученный фильтрат высушивали распылом, либо упаривали в 8 - 10 раз пообъему. В первом случае предварительно вфильтрат добавляли фосфорнокислый аммоний (10% вес. по сухим веществам) в качестве диспергаторэ и клей КМЦ (5 вес. посухим веществам) в качестве поверхностноактивного вещества, Концентрация экзотоксина в сухом препарате составила 3,9% вес.ЛК - 50 на комнатной мухе - 0,006 . Во втором случае после упаривэния в раствор добавляли 0,1 объема диметилсульфоксида(ДМСО) и 0,005% объема бриллиантовогозеленого в качестве стабилизатора экзотоксина и консерванта и клей КМЦ(5% вес. посухим веществам) в качестве поверхностноактивного вещества, Концентрация экзотоксина в жидком препарате составила 10 г/л(1 ), ЛК - 50 на комнатной мухе - 0,01 о ,П р и м е р 2, Выращивание культуральной жидкости Вас, Фигп 9 епяз штамма202-1 с проводили в ферментаторе обьемом8 л на поликомпонентной питательной среде (ППС) следующего состава,:дрожжи кормовые 2,8мука кукурузная 1,4кальций хлористый 0,3гидролизат шрота хлопкового 3,0зеленая патока 1,0синтетический пеногаситель 0,03Культивирование проводили при условиях, описанных в примере 1, Содержаниесухих веществ в полученной КЖ составляло2,2 г/л, рН=(6,0+-0,5) ед, рН, содержаниеэкзотоксина - 0,28 г/л,Из полученной КЖ был получен экзотоксин в соответствии с условиями примера 1,данные представлены в табл. 4 - 6,Потери экзотоксина (г/л) и его содержание в сухом концентрате (г/кг) после ультрафильтрации на мембранах с разнымиразмерами пор,Потери зкзотоксина (г/л) и его содержание (г/кг) в сухом концентрате после очистки фильтрата в зависимости от содержаниязкзотоксина В концентрате фильтрата (г/л),1792613 25 30 Таблица 1 Содержание (г/кг) экзотоксина в сухом концентрате после очистки фильтрата в зависимости от его рН,Затем полученный фильтрат высушива ли распылом, либо упаривали в 2 - 3 раза по объему и далее поступали так же, как и в первом примере. Концентрация экзотоксина в сухом препарате составила 3,5 вес, ЛК - 50 на комнатной мухе - 0,006. Концен трация экзотоксина в жидком препарате составила 8 г/л (0,8 ). ЛК - 50 на комнатной мухе - 0,1 4.Содержание и потери экзотоксина измерялись с помощью тонкослойной хрома тографии и спектрофотометрирования при длине волны 260 нм по способу (2), Ошибка измерений не превышала+-3. ЛК - 50 рассчитывалась по методу Кербера (3). 20Расчет себестоимости единицы продукции экзотоксинсодержащего препарата проведен на основании данных по стоимости оборудования, материалов, сырья. Формула изобретения Способ получения экзотоксинсодержащего препарата из раствора путем концентрирования, отл ича ю щий ся тем,что, с целью снижения себестоимости целевого продукта, концентрирование осуществляют Перечень оборудования, необходимого для получения экзотоксинсодержащего препарата, представлен в табл, 8, где приведены наименование и стоимость оборудования, применяемого при получении экзотоксинсодержащего препарата.Нормы расхода сырья и материалов для получения экзотоксинсодержащего препарата представлены в табл. 9,где показаны нормы расхода сырья и материалов на получение единицы веса экзотоксинсодержащего препаратаНа основании приведенных данных видно, что отличие в затратах по получению сухих и жидких препаратов заключается в разных соответствующих расходах электроэнергии и материалов. С учетом этого можно подсчитать разницу в ценах единиц продукции препарата, полученного разными способами (см. табл, 1 О).Таким образом, применение данного способа позволяет снизить себестоимость препаратов при сохранении его потребительских характеристик ультрафильтрацией на мембранах с размером пор по пропусканию белков с мол. м.5000-10000 Да, в полученном концентрате рН устанавливают 4,5 - 5,5, затем концентрат упаривают до содержания экзотоксина 2,4 - 4,8 г/л и повторно проводят ультра- фильтрацию на вышеуказанных мембранах.1792613Таблица 2П р и м е ч а н и е, Размер пор мембраны равен 10000 Да, рН фильтрата 5,0,Таблица 3П р и м е ч а н и е, Степень концентрирования равна 10, размер пор мембраны 10000 ДаТаблица 4Таблица 5 П р и м е ч а н и е. Размер пор мембраны равен 10000 Да, рН фильтрата 5,0 Таблица 6 ентрировэния равна 10, размер пор мембраны 10000 Да меча ние, Степен 1792613 блицаблица 10 Составитель А.Соломинедактор Т,Никольская Техред М,Моргентал Корректор Е.П оиэводственно-издательский комбинат "Патент . г, Ужгород, ул.ГагаринаО Заказ 464 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКН Г СССР113035, Москва, Ж-З 5, Раушская наб., 4/5