Способ количественного определения -экзотоксина в инсектицидном препарате

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(23) Приоритет Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытийОпубликовано 3009,82, Бюллетень Кф 36Дата опубликования описания 300982 33 УДК 543. 89. 062: и 543.544.632. .951.2(088.8) С.Н.Бубенщикова, В,К,Каграманова, Л.А.Баратов,Э.Б.Данилова и Е.Б.КруглякгМосковский ордена Ленина, ордена ОктябрьскойРеволюциии ордена Трудового Красного Знамени государственныйуниверситет им. М.В.Ломоносова(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ-ЭКЗОТОКСИНА В ИНСЕКТИЦИДНОМ ПРЕПАРАТЕ Изобретение относится к способам анализа инсектицидных препаратов и может быть использовано в сельском хозяйстве, ветеринарии, .микробиологической и медицинской промышленнос- ти, пои пооизводстве и поименении инсектицидных поепаоатов, содержащих ф -экзотоксин, а также для санитарно-гигиенического контроля внешней среды. Известен способ количественногоопределения Д-экзотоксина в инсективидных препаратах путем биоиспытанийна тест-насекомых 11. Однако указанный способ требует дополнительного оснащения в виде инсектария или пункта, снабжающего исследователя тест-насекомыми. Промежуток времени, необходимый для получения ответной реакции живого объекта, исчисляется 1-2 нед.Погрешность определения 25. Все это значительно ограничивает поименение метода как в практической, так и в исследовательной работе.Известен также способ количественного опоеделения Ъ -экзотоксина путем хроматограФирования препарата на анионообменной смоле с последующей эмоцией р -экзотоксина и Уф-спектройотометрирования элюата 2 ) .Существенным недостатком известного метода является суммарное спектрофотометрическое опоеделение мног.;хкомпонентов, сопутствующих-экзотоксину и имеющих максимум поглощения, близкий к максимуму поглощения-экзотоксина, В результате этогопри спектрофотометрировании определяют поглощение смеси этих компонентов (продуктов деструкции -экзотоксинов и др,) с-экзотоксином, которое принимают за поглощение-экзотоксина. Количествовеществ, сопутствующих .р -экзотоксину,.зависит от степени его очистки и от методов выделения. Вторымнедостатком метода является длительная подготовка исследуемого образцак непосредственному количественному анализу.Цель изобретения - увеличениеточности и чувствительности анализа 25 с одновременным его ускорением.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу количественного определений-экзотоксина используют смолу с размером частиц 7-15 мкм, а элюцию проводят пр:4 962811 скорости 15-60 мп/ч. темпеоатуое 20-50 С и пои форме градиента кривой элюции У = ХПри работе со смолой, диаметр частиц которой меньше 7 мкм, плядостижения скорости элюции 15-60 мп/ч 5 .требуется значительное увеличение рабочего давления в .колонке, что приводит к быстрой потере проницаемости колонки и сокращает срок ее эксплуатации. Уменьшение же скорости 10 элюции нежелательно, поскольку увеличивается продолжительность анализа. Использование в качестве стационар.ной фазы частиц диаметром более 15 мкм значительно ухудшает качество раздепени."Наиболее оптимальной Формой градиентной кривой является У =Х. при использовании которой удается достигнуть полного разрешения всех компонентов анализируемых смесей при минимальном уширении зон сорбции,Применение линейной формы градиента У=Х с различным наклоном гоадиентной прямой обеспечивает хорошее отделение пика Д -экзотоксинаг 5 от слабо сорбируемых на колонке соединений, однако приводит к значительном размывайию зон сорбции веществ, имеющих величину времени/ удерживания более 20 мин, что в 5- З 0 10 раз снижает чувствительность анализа.Использование градиентной кривой У=Х+ не позволяет достигнуть хо рошего разрешения пиков, имеющих не большое различие времен .удерживания. В частности, в.этих условиях происходит частичное перекрывание пиков соответствующих р -экзотоксину и/ его лактону., 4 ОПроведение элюции пои комнатной температуре 120 ОС 1 поиводит к размыванию зон сорбции, увеличению воемени удерживания веществ на колонке, плохому разрешению пиков. Про" ведение элюции при темпЕратуре выше 50 ОС не желательно вследствие лабильности р -экзотоксина при температуре выше 50 ОС.Проведение элюции при скорости потока 15 мл/ч нежелательно, так как увеличивается время анализа ипроисходит Размывание Зон сорбции. Элюирование при скорости потока 60 мл/ч значительно сокращает время анализа, но ухудшает разрешение пиков, имеющих небольшое различие времен удерживания. Компоненты препарата идентифицируют по их поглощению при 260 нм. 60 Количество-экзотоксина определяют по величине поглощения в пике с определенным временем удерживания, определяемым по калибровочной кривой. 65 Для построения калибровочной кривой аликвоты стандартного растворар -экзотоксина хроматографирун 5 т и.определяют площади пиков по формуле1 Цгде Н - высота пика,И- ширина пика на половине высоты.Величину калибровочного коэффициента определяют по ФормулеКБгде К, - калибровочный коэффициент,С - количество Р-экзотоксина1 рассчитанное), внесенногов колонку,Я - йлощадь пика.Вычисление процента содержанияР -экзотоксина проводят по Формуле962811Таблица 1 Содержание ф-экзотоксина, Ъ Источник р -эк- зотоксина Се- рия Предлагаемый способ Спектрофотометрическийспособ 1,9 0,3 0,4 2,3 Культуральныежидкости 3,2 1,7 2,2 1,3 16,4 15,0 2,8 4,4 4,6 3,8 Инсектицидтурингин 13,8 26,3 2,0 4,1 смолой Фирмы фН 11 асМ" типа 2632 с размеоом частиц 10 мкм в С 1"-форме и разделение осуществляют при.1 скорости потока 18 мп/ч в условиях градиентной элюции деформа градиентной кривой У=Хф) двумя растворами содержащими НС 1 и ЫаС 1 .в концентрации 0.0025 н. НС 1 и 0,005 М МаС 1 11), 0,01 н. НС 1 и 0,2 ММаС 1 2).Детектирование осуществляют в проточной кювете с.объемом 8 мкл при длине волны 260 нм. Время удерживания Ф-экзотоксина 28 мин. Ощиб,ка измерения +5.Предлагаемий способ количественного анализа р -экзотоксина отли- чается от известного спектрофотожтрического способа более высокой точностью, поскольку в результате хроматографии .инсектицидных препаратов в указанных выае усло. виях происходит полное разделение Уф-поглощающих компонентов, содержащихся в анализируемой смеси, и отделение от них-экзотоксина. содержание которого далее рассчитывается путем построения соответ- ствующей калибоовочной кривой зази 1 симости концентрации ф -экзотоксина от величины площади его пика на хроматограмме. При этом величинастандартной сцаибки определения не .превыщает 2,5-3,0. В случае.анализа инсектицидных препаратов известным сйектрофотометрическим способом для очистки препаратов и выделения в-экзотоксина используютсорбцию на активированном угле и,неэффективную хроматографию наколонке с сорбевтом ДОыех, чтоне позволяет получить Ь "экзоток"син в индивидуальном состоянии. Исследуемый спектрофотометрическнмспособом элюат содержит, наряду с/Р -экзотоксином, значительное количество других Уф-поглощающих веществ, 10 образовавшихся в процессе биосинтеза инсектицида. В оезультате этогопо суммарному поглощению растворовнельзя с достаточной точностью судить о содержании в них самого 15 Р -экзотоксина.В табл.1 приведены данные, полученные.предлагаеыям и спектрофото"метрическим способами анализа серии кчльтуоальиых жидкостей выделен;р ньпс в тюиессе биосинтеза 9 -экзотоксина а также препаратов инсектицида .турингина, действующим началомкоторого является р -экзотоксии,В табл.2 в качестве .ежмеоа даныоезультаты, полученные пои анализекультуральной жидкости серии 3;Чувствительность поедлагаемогоспособа анализа-экзотоксина позволяет,с указанной величиной стандартной оюибки количественно опоеделятьего пои содержании 0,1 мкг и болеев анализируевюм образце. Спектрофатовезтрический способ дает возмож. -.ность количественно анализироватьоастворы содежание не менее 100 мгкр -экзотоксина в анализиоуемой пробе962811 Таблица 2 Относительнаястандартнаяошибка (К Ъ Величина стандартного отклонения (х/Я) Количествоъ-экзотоксина в пробе, мкг Величина среднего ариФметического (х) 6,52 6,85 0,12 6,50 1,84 6,27 6,19 6,70 Формула изобретения Составитель Л.РубиноваТехред М. Надь Корректор Е Рошко Редактор С,Юско Заказ 7498/62 Тираж 887 11 одписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ПЧП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Способ количественного определения-экзотоксина в инсектицидном препарате путем хроматограФирования препарата на анионообменной смоле с последуюшей элюцией-экзотоксина и УФ-спектройотометрирования элюата о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения точности и чувствительности анализа с одновременным его ускорением, используют смолу с размеромчастиц 7-15 мкм, а элюцию проводятпри скорости элюции 15-60 мл/ч.температуре 20-50 ОС и при Формеградиента кривой элюции У=ХИсточники инФормации,принятые во внимание при экспертизе1, Тонконоженко А.П., Кац М.Б.,Труды ВНИИВС, т, 63, с. 9-13, 1979,2. ЯозепЬег 9 С., Саг 1 ЬегцЗО Су 11 епЬегу М,С 1 Арр 1. Вастег(о 1,34(2), 417, 1971.