Способ определения алкил-динитрофенолов в биологическом материале

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1786426 1)5 6 01 й 31/00, 30 ПИСАН ЗОБРЕТЕНИ АВТОРСКОМ ИДЕТЕЛ ЬСТВ(57) Использование: в аналитической химии, Сущность изобретения: биологическую пробу измельчают, неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют и упаривают до сухого остатка, остаток растворяют в гидрофобном растворителе, обрабатывают водно-щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляют до рН 2 - 3, экстрагируютдиэтиловым эфиром, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-гексан (7;4). 4 табл,ыи медицинскии,Нестерова сикологичес , с.119-123, Химико-токс ища школа,вяхи коло,едования в ветелогические мето: Агропромиздат,НИЯ АЛКИЛДИ- ОЛОГИЧЕСКОМ Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения алкилдинитрофенолов в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидемстанций, химико-токсикологических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.Известен способ определения органических веществ в биологическом материале путем измельчения исследуемого биологического объекта, неоднократного настаивания с этанолом (каждый раз в течение 1 сут), объединения вытях ек, сгущения объединенного извлечения, осаждения в нем белков абсолютным этанолом, фильтрования, упаривания фильтрата анализируемых соединений органическим растворителем сначала из кислого, а затем из щелочного раствора,Способ трудоемок, требуе ных затрат времени на его ос характеризуется низкой степе ния алкилдинитрофенолов и ти Вностью.Известен способ определ ческих веществ кислого хара рым относятся и алкилдини биологическом материале, за в измельчении биологическог работке водным раствором ги трия, центрифугировании центрифугата вольфраматом лой среде при кипячении наотделении осадка центрифуг течение получаса, экстракцио нии анализируемых соединен фугата эфиром с по подщелачиванием центрифуг ной экстракции эфиром. т значител ществлени нью извлеч малой селе ения органи- О 0 ктера (к кото ФГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(56) 1. Ш вайкова М,Д, Токмия, М,; Медицина, 19752. Кра марен ко В, Ф.гический анализ, К,: Вс,123 - 124.3, Лабораторные исслринарии. Химико-токсикоды. ред, Б,И.Антонова, М1989, с,167.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИТРОФЕНОЛОВ В БИМАТЕ РИАЛ Е трофенолы) в ключающийся о обьекта, обдроксида наобработке натрия в кисодяной бане, ированием в нном выделеий из центриследующим ата и повтор 1786426Способ малоселективен, отличается низкой степенью извлечения алкилдинитрофенолов,Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемым результатам является способ определения алкилдинитрофенолов (каратана) в биологических объектах путем измельчения биологической ткани, неоднократной ее обработки порциями гексана каждый раз в течение 30 мин, отделения гексановых извлечений, их объединения и упаривания до сухого остатка с последующим растворением остатка в легколетучем органическом растворителе, хроматографированием в тонком слое силикагеля в системе растворителей гексан-ацетон (4:1).Способ характеризуется недостаточно высокими чувствительностью и селективностью,Цель достигается предлагаемым способом, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют и упариваютдо сухого остатка, остаток растворяют в гидрофобном растворителе, обрабатывают водно-щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляют до рН 2-3, экстрагируют диэтиловым эфиром, экстрагент отгоняют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-гексан (7:4).Сопоставительный анализ предлагаемого решения и прототипа показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что биологическую ткань обрабатывают ацетоном, сухой остаток растворяют в гидрофобном растворителе, обрабатывают щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляют до рН 2 - 3, экстрагируют диэтиловым эфиром, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографирование осуществляют в системе растворителей хлороформгексан при их объемном соотношении 7;4,Сравнение предлагаемого решения не только с прототипом, но и с другими техническими решениями в данной области техники не позволяет выявить в них признаки, отличающие предлагаемое техническое решение от прототипа, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения критерию существенных отличий.Способ осуществляется следующим образом, Биологическую ткань, содержащую алкилдинитрофенолы, измельчают, трижды настаивают с ацетоном (каждый раз в тече ние получаса), ацетоновые извлечения тделяют от твердых частиц биоматериала объединяют, ацетон испаряют, сухой ос аток растворяют в гидрофобном раствори еле, экстрагируют водно-щелочным раств ром,щелочнои раствор отделяют, подкисляют до рН 2 - 3, экстрагируют диэтиловым эфиром,ют вэкстрагент отгоняют, остаток раствор ацетоне и хроматографируют в тонком силикагеля с системе растворителей х форм-гексан (7:4).П р и м е р 1, Определение 2-мети динитрофенола в ткани печени,лое 10 ро,6 К 50 г мелкоизмельченной ткани св жей15 трупной печени человека прибавляют 5 мг2-метил,6-динитрофенола, тщательнремешивают биологическую ткань с вевом и оставляют на 1 сут при 18 - 20истечении этого времени смесь зал вают20 100 мл ацетона и выдерживают 0,5 ч,одически перемешивая, Извлечение отют и операцию настаивания повторяюдважды. Ацетоновые вытяжки объединиспаряют до сухого остатка в токе во духа25 пе- ест. По яют,при комнатной температуре, Остаток творяют в 50 мл хлороформа, Получе раствор трижды экстрагируют щело буферным раствором с рН 9,5 (порция 50 мл к расный ным и по еляаждая), Щелочные экстракты от единяют, подкисляют 24-ны хлороводородной кислоты до р агируют порциями диэтиловог ды по 100 мл. Эфирные извлеч няют, эфир испаряют. Сухой ос ряют в ацетоне, раствор перенколбу объемом 50 мл и довод цетоном. 0,1 мл этого раствора линию старта хроматографич ют, обътвором и экстр ра триж объеди раство мерную метки а сят на 30 35 2 - 3 эфиения аток сят в ской хрома хлоро н итро в вид пластины типа Силуфол ОЧи фируют в системе растворителей гексан (7:4). 2-Метил,6-ди проявляется на хроматограмме того пятна с юг=0,42,Для определения количеств ного 2-метил,6-динитрофенол 40 орм- нол жел ечен- пени извл ст45 аи звлечения участок хроматографич ластины с пятном вещества выреза абатывают 5 мл диметилформам ильтрую образующийся окрашенны вор в спектрофотометрическую к Оптическую плотность раствора изм а спектрофотометре СФпри длин ы 435 нм, Измерения проводят на аствора, полученного в контрольномскои , обда и асту. ют вол- оне те. Количественное 4,6-ди н ит рафе н ол уравнению калибров считывают на навеску в биологический матеПостроение кали содержание 2а определяючного графикавещества, внериал.бровочного гра метил по и пере енную5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 На линию старта хроматографической пластины типа Силуфол ОЧнаносят 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,80, 1,20, 1,60 мл 0,005 Д, раствора 2-метил,6-динитрофенола в ацетоне и осуществляют хроматографирование в системе растворителей хлороформ-гексан (7;4). 2-Метил,6-ди н итрофенол обнаруживается на хроматограмме в виде желтых пятен с ВЫ=0,42. Участки пластины с находящимися на них пятнами вещества вырезают и элюируют каждое пятно 5 мл диметилформамида в течение 5 мин, Извлечения фильтруют непосредственно в спектоофотометрические кюветы чеоез бумажный фильтр, оптическую плотность измеряют при 435 нм на спектрофотометре, Раствор сравнения - элюат, полученный при проведении контрольного опыта. По результатам измерений строят график зависимости оптической плотности растворов от концентрации определяемого вещества, Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид0=0,08495 С+0,0005,где О - оптическая плотность;С - концентрация окрашенного раствора, мкгlмл.Результаты определения 2-метил,6- динитрофенола в ткани печени представлены в табл,1,П р и м е р 2, Определение 2-втор-октил,6-динитрофенола в ткани печени.К 50 г мелкоизмельчен ной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 26 мг 2-втор-октил,6-динитрофенола, тщател ьно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1 сут при 18- 20 С, По истечении этого времени смесь заливают 100 мл ацетона и выдерживают 0,5 ч, периодически перемешивая. Извлечение отделяют и операцию настраивания повторяют еще дважды, Ацетоновые вытяжки объединяют, испаряют до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяют в 50 мл гексана. Полученный раствор трижды экстрагируют щелочным раствором универсальный буфер с рН 11,98, разбавленный водой в четыре раза) порциями по 50 мл. Щелочные экстракты отделяют, объединяют, подкисляют 24 - ным раствором хлоповодородной кислоты до рН 2 - 3 и экстрагируют порциями диэтилового эфира трижды по 100 мл. Эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют. Сухой остаток растворяют в ацетоне, раствор переносят в мерную колбу объемом 50 мл и доводят до метки ацетоном, 0,1 мл этого раствора наносят на линию старта хроматографической пластины типа Силуфол ОЧи хроматографируют в системе растворителей хлороформ-гексан (7;4), 2- втор-Октил,6-динитрофечол проявляется на хроматограмме в виде желтого пятна с 81=0,76,Для определения количества извлеченного 2-втор-октил,6-динитрофенола и степени извлечения участок хроматографической пластины с пятном ве. щества вырезают, обрабатывают 5 мл диметилформамида и фильтруют образующийся окрашенный раствор в спектрофотометрическую кювету. Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре Сфпри длине волны 445 нм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание 2-втор-октил;6-динитрофенола определяют по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в биологический материал. Построение калибровочного графика, На линию старта хроматографической пластины типа Силуфол ОЧнаносят 0,025, 0,05, 0,10, 0,20, 0,30, 0,40, 0,50, 0,60, 0,70, 0,80, 0,90, 1,00 мл 0,005;ь-ного раствора 2-втор-октил,6-динитрофенола в ацетоне и осуществляют хроматогоафирование в системе растворителей хлороформ-гексан (7:4), 2-втор-Октил,6-динитрофенол обнаруживается на хроматограмме в виде желтых пятен с Я 1=0,76. Участки пластины с находящимися на них пятнами вещества вырезают и элюируют каждое пятно 5 мл диметилформамида в течение 5 мин. Извлечения фильтруют непосредственно в спектрофотометрические кюветы через бумажный фильтр, оптическую плотность измеряют при 445 гм на спектрофотометре. Раствор сравнения - элюат, полученный при проведении контрольного опыта, По результатам измерений строят график зависимости оптической плотности растворов от концентрации определяемого вещества, Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид0=0,05545 С+0,00504,где О - оптическая плотность;С - концентрация окрашенного раствора, мкг/мл.Результаты определения 2-втор-октил,6-динитрофенола в ткани печени приведены в табл,2.П р и м е р 3, Определение 4-втор-октил,6-динитрофенола в ткани печени.К 50 г мелкоизмельчен ной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 25 мг 4-втор-октил,6-динитрофенола, тщател ь 1786426гра ств Построение калибровочного графика, 4 На линию старта хроматографической пластины типа Силуфол ОЧнаносят 0,02, 0,04, 0,08, 0,16, 0,32, 0,48, 0,64, 0,80 мл 0,0050-ного раствора 4-втор-октил,6-динитрофенола в ацетоне и осуществляют хро матографирование в системе растворителей хлороформ-гексан (7:4). 4- втор-Октил,6-динитрофенол обнаруживается на хроматограмме в виде желтых пятен с В 1=0,70. Участки пластины с находящими ся на них пятнами вещества вырезают и элюируют каждое пятно 5 мл диметилформамида в течение 5 мин, Извлечения фильтруют непосредственно в спектрофотометрические кюветы через буно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1 сут при 18- 20 С. По истечении этого времени смесь заливают 100 мл ацетона и выдерживают 0,5 ч, периодически перемешивая, Извлечение 5 отделяют и операцию настаивания повторяют еще дважды, Ацетоновые вытяжки объединяют, испаряют до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре, Остаток растворяют в 50 мл гексана, Полученный 10 раствор трижды экстрагируют щелочным раствором (универсальный буфер с рН 11,98, разбавленный водой в четыре раза) порциями по 50 мл. Щелочные экстракты отделяют, объединяют, подкисляют 240 - 15 ным раствором хлороводородной кислоты до рН 2 - 3 и экстрагируют порциями диэтилового эфира трижды по 100 мл, Эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют, Сухой остаток растворяют в ацетоне, рас твор переносят в мерную колбу объемом 50 мл и доводят до метки ацетоном. 0,1 мл этого раствора наносят на линию старта хроматографической пластины типа Силуфол ОЧи хроматографируют в системе 25 растворителей хлороформ-гексан (7:4), 4- втор-Октил,6-динитрофенол проявляется на хроматограмме в виде желтого пятна с Я 1=0,30.Для определения количества извлечен ного 4-втор-октил,6-динитрофенола и степени извлечения . участок. хроматографической пластины с пятном вещества вырезают, обрабатывают 5 мл диметилформамида и фильтруют образующийся 35 окрашенный раствор в спектрофотометре СФпри длине волны 490 нм, Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание 4-втор-октил,6-динитрофенола оп ределяют по уравнению калибровочногофика и пересчитывают на навеску веще- а, внесенную в биологический материал.мажный фильтр, оптическую плотность измеряют при 590 нм на спектрофотоме ре, Раствор сравнения - элюат, получен ый при проведении контрольного опыта. По результатам измерений строят график завйсимости оптической плотности растворо от концентрации определяемого вещес ва. Методом наименьших квадратов рассч тывают уравнение калибровочного граф ка, которое в данном случае имеет вид0=0,02576 С+0,00482, где 0 - оптическая плотность С - концентрация окрашенного рас вора, мкг/мл,Результаты определения 4-втор-ок ил,6-динитрофенола в ткани печени прив дены в табл.3,Предлагаемый способ по сравнению с прототипом повышает степень извлечения алкилдинитрофенолов из ткани печени 2,5 раза и чувствительность определения в 4 раза, В отличие от прототипа предлагае ый способ более селективен и позволяет о ределять алкилдинитрофенолы в присутс вии различных классов органических соед нений: производных тропана (тропино ого эфира б,1-траповой кислоты, скопино ого эфира 1-траповой кислоты), пиперидина (1,2,5-триметил-е-пропионилокои-е-фенллпиперидина), хинуклидина (3-ацетокс хинуклидина), хинолина ( 3-диэтиламино тиламида-бутоксицинхониновой кисл ы), 4-(1-метил-ди этил а ми но)-7-хлорхинол и на, 2-(4-нитростирил)-4-(1 -метил-диэтиламинобутиламино)-6-метоксихинолина, 6-ме оксихинолил-(4 Я 5-вин ил хинукл ид и л -(2) )- карбинола), фенотиазина(2-хлор-(3-д метиламинопропил)-фенотиазина, 10-(3 диметиламинопропил)-фенотиазина, 10-(2-диметиламиноп ропил)-фенотиазина, хинолизидина (а-спартеина), пирролизидина (платифиллина), изохинолина 6,7-диме 4 токси(3,4 -диметоксибензил)-изохин олин а,фенантренизохинолина (морфина, ко еина), имидазола (пилокарпина).Сравнительная характеристика пре лагаемого и известного способов предста лена в табл.4. Формула изобретения Способ определения алкилдинитр фенолов в биологическом материале путе измельчения пробы обработки органиче ким растворителем, упаривания, растворения полученного сухого остатка и хроматографирования раствора в тонком слое сил кагеля,отл ичающийсятем,что,сце ью повышения чувствительности и селекти но1786426 Таблица 1 Результаты определения 2-метил,6-динитрофенола в ткани печени Таблица 2 Результаты определения 2-втор-октил,6-динитрофенола в тканипечени Таблица 3 еРезультаты определения 4-втор-октил,6-динитрофенола вткани печени сти способа, в качестве органического растворителя используют ацетон, сухой остаток растворяют в гидрофобном растворителе, обрабатывают щелочным раствором, щелочной раствор отделяют, подкисляютдо рН 2 - 3, экстрагируютдиэтиловым эфиром, экстрагент испаряют, остаток растворяют в ацетоне и хроматографирование осуществляют в системе растворителей хлороформ - гексан при их 5 обьемном соотношении 7;4,12 1786426 Та блица 4 Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов (на примере 2-метил,6-динитрофенола) Предлагаемый способ Известный способ Показатель 28,834 о Э 04 Степень извлечения, 4 Чувствительность, мг в50 г печени 0,5 Селективность ано ставитель В. Шхред М,Моргент Коррект Реда кт з 245 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открыт 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород,Позволяет селективно определять алкилдинитрофенолы в присутствии производных тропана (тропинового эфира Й 1-троповой кислоты, скопинового эфира 1-троповой кислоты); пиперидина (1,2,5-триметил-пропионилокси"Фенилпиперидира); хинук" лидина (З-ацетоксихинуклидина, 3-бензоилоксихинуклидина); хинолина (/1-диэтиламиноэтиламита-бутоксицинхониновой кислоты), 4-(1 -метил-диэтил" аминобутиламино)"7"хлорхиноли" на, 2-(4 -нитростирил)", 4-(1 метил-диэтиламинобутилами"но) -6-метоксихинолина 6 -метоксихинолил-(4) - 5-винилхинуклидил) -(2) -карбинола);фенотиазина 1.2-хлор-(3 -ди" метиламинопропил)-Фенотиазина1 0"(3 -диметиламинопропил)- фенотиазина 10-(2 -диметиламинопропил)-фенотиазина хинолизидина (А"спартеина);пирролизидина (платифиллина); изохинолина 6, 7-диметокси" (3 ,4 -диметоксибензил)-изо" хинолина ; Фенатренизохинолина (морфина, кодеина) имидазола (пилокарпина) Не позволяет селективно определять алкилдинитрофенолы в присутствии производных тропана (тропинового эфира 6 1-троновой кислоты, скопинового эФира 1-троповой кислоты); пиперидина (125-триметил-пропионилокси-фенилпиперидина); хинуклидина (3-ацетоксихинуклидина, 3-бензоилоксихинуклидина); хинолина 1-диэтиламиноэтил" амида-бутоксицинхониновой кислоты), 4-.(1 -метилди"этиламинобутиламино)-7-хлорхинолина 2-(4 -нитростирил)-4-(1 "метил"4-диэтиламинобутил амино)"6"метоксихинолина;6-метокскхинолил-(4)-5-винилхинуклидил-(2)1 -карбинола фенотиазина 12-хлор-(3-диметиламинопропил)-фенотиазина, 10 -(3-диметиламинопропил)-Фенотиазина. 10-(2 "диметиламинопропил)"Фенотиазина .; хинолизидина (ц(-спартеина); пирроли" зидина (платифиллина); изохинолина(67-диметокси-(3,41 диметоксибензил)-изохинолина 1; Фенантренизохинолина (морфина, кодеина); имидазола (пилокарпина)