Способ определения концентрации лактогенных рецепторов

СО 03 СОВЕСКИХсОциАлистическиРГСПУБЛИК 751665 А 01 й 33/04 1 А 17 О ь,РЕТЕН ИС НИЕ МУ СВИ ЕЛЬ ВТОРСКОееею ляетсялактоге ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(71) Всесоюзный научно-исследовательскийинститут разведения и генетики сельскохозяйственных животных(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛАКТОГЕННЫХ РЕЦЕПТОРОВ Изобретение относится к биологии - кспособам исследования и анализа материалов путем определения их физико-химиче-.ских свойств, в частности к способамисследования компонентов молочных продуктов посредством рецепторного анализатора с использованием меченых гормонов,Известен способ определения концентрации лактогенн х рецепторов,При этом способе рецепторный материал получают путем взятия ткани молочнойжелезы у коров, .Недостатком этого способа является ограниченность количества рецепторного материала, трудоемкость его выделения ихирургическое вмешательство при взятииткани молочной железы, приводящее к еетравмированию.Наиболее близким к предлагаемому явспособ определения содержаниянных рецепторов.(57) Использование: биология, исследование компонентов молочных продуктов посредством рецепторного анализа с использованием меченых гормонов, Сущность изобретения: из проб молока коров выделяют мембраны жировых глобул, Рецепторный анализ проводят в присутствии меченого 1и немеченого пролактина: Последний 125используют в концентрации 0,84-120 нМ, инкубируют в буфере с рН 4,5-5,0, Центрифугируют полученную смесь, измеряют значение радиоактивности полученного осадка, Устанавливают количество связанного меченого пролактина ийо нему определяют концентрациюлактогенных, рецепторов, 2 ил. 3 таблСуть способа-прототипа заключается в том, что мембраны жировых шариков выделяют из молока кроликов и подвергают рецепторномту анализу путем добавления меченогои немеченого пролактина.25Смесь помещают в инкубационный буфер с рН 7,4 - 7,5 и выдерживают в течение 24 ч, затем мембраны отделяют от буфера центрифугированием. Количество связанного меченого пролактина определяютпо радиоактивности осадка, концентрацию рецептора определяют по графику Скэтчарда,Недостатком прототипа является условие связывания пролактина с мембранами жировых шариков, а" ййенйо йрименение инкубационного буфера с рН 7.4-7,5, при котором невозможйо определить содержание лактогенных рецепторов на мембранах жировых шариков молока коров,Цель изобретения - повышение точности способа,Укаэанная цель достигается ем, чтопир инкубировании смеси мембран жировых глобул молока коров используют буферс рН 4,5 - 5,0 и немеченый пролактин в концентрации 0,84 - 120 нМ.Проведение рецепторного анализа вкислой среде увеличивает точность и чувствительность способа, так как в интервалерН 4,5 - 5,Ь обеспечиваются оптимальныеусловия специфического связывания пролактина с мембранами жировых шариковмолока коров.Использование инкубационного буфера с рН 4,5 - 5,0 позволяет получить достоверные значение содержания рецепторов влактогенных гормонах.При значении рН инкубационного буфера менее 4,5 пролактин выпадает в осадок,что ведет к искажению данных о количествепролактина и препятствует проведению рецепторного анализа, При значениях рНбольше 5,0 снижается процесс специфического связывания пролактина с мембранами жировых шариков молока, вследствиеэтого уменьшается точность и чувствительность способа,Влияние рН на специфическое связывание пролактина с мембранами секреторныхклеток молока крольчих известно: традиционное значение рН инкубационногб буферасоставляет 7,4 - 7,5. Влияние рН на специфическое связывание пролактина с мембранами жировых шариков молока коровнеизвестно,Уточнение диапазона концентрации немеченого пролактина, добавляемого в инкубационный буфет, позволяет сократитьобъем экспериментов и увеличить точностьспособа, так как в нужном диапазоне кон. центрации немеченого пролактина получают больше данных по связываниюпролактина с лактогенными рецепторамимембран жировых глобул молока.С использованием математических методов при обработке полученных данныхболее точно определяется концентрациялактогенных рецепторов мембран жировыхглобул молока коров.Выбор оптимальных концентраций немеченого пролактина обусловливаетсясвойствами исходного рецепторного материала, а именно константами сродства пролактина и лактогенных рецепторов, а такжеконцентрацией лактогенных рецепторов,Эти свойства изучены для лактогенныхрецепторов, локализованных на плазматических мембранах секреторных клеток тканей различных органов, Для мембранжировых глобул молока рецепторный анализ проведен только у кроликов.20 где Всп - количество специфически связанного гормона;1 - равновесная концентрация свободного гормона,и - количество центров связывания.Для определения параметров системы(К и О) наиболее часто применяют методы,основанные на преобразовании уравнения(1) к виду, удобному для графического определения параметров. Широкое распространение в настоящее время получилопредставление данных по гормон-рецепторному взаимодействию в координатах35 Скэтчарда Всп/ =(0/К - (1/К) В(2) 40 где В - количество гормона, специфическисвязанного с центром связывания.В случае одного типа рецепторов этоуравнение характеризует линейную зависимость между отношением количества свя 45 эанных и свободных молекул гормона (Всп/1)и концентрацией гормон-рецепторного комплекса(Всп), График этой зависимости представляет собой прямую линию с наклоном -1/К, которая отсекает на оси ординат отре 50 зок, равный О/К, а на оси абсцисс О,В случае существования 2 типов рецепторов график Скэтчарда представляет собойвогнутую кривую, асимптоты к которой отсекают на оси ординат отрезки, равные 0/К55 и 02/К 2, а на оси абсцисс 01 и 02,П р и м е р, Берут 400 мл молока коровы,центрифугируют в течение 30 мин при 18000о, Полученные сливки промывают трехкратно 0,25 М раствором сахароэы (10 т М Впеозые установлен оптимальный диапаэон концентрации немеченого пролакти на для проведения рецепторного анализа мембран жировых глобул молока коров, 5 Константу диссоциации (К) и непосредственноконцентрацию рецепторов (О) определяют по графику Скэтчарда методом регрессионного анализа (с помощью программы "Дельта", разработанной в МГК, для двух центровой модели связывания).Указанные параметры являются основ-.ными физико-химическими параметрами, характеризующими процесс комплексообразования, Модельная функция, описывающая 15 связывание лиганда со специфическимицентрами, имеет вид1751665МдОг), замораживают в концентрации 35",ь но оь г 1 ролак ива с мембранами жировыхпо жиру при -40 С в течение 18 ч. Затем глобул малом. Этим объясняются граничсливки нагревают до 36 С, центрифугируют ные значения концентрации немеченогов течение часа при 100 000 д(4 С), Осадок пролактина, взятые в пределах от 0,84 допромывают 2 раза 0,04 М фосфатно-цитрат 120 нМ,ным буфером с рН 4,8 (10 п 1 М МдС 2), осаж- Результаты излучения влияния величидают при центрифугировании в течение ны рН инкубационной среды на специфичечаса при 0000 д(4 С),ское связывание пролактина представленыПолученные мембраны гомогенизируют в табл. 3 и фиг. 2,в промывочном буфере и определяют кон Результаты экспериментов подтвержцентрацию белка методом Лоури, В 14 про- дают правильность выбора значений рН инбирок, содержащих по 05 мл мембран в кубационного буфера. равных 4,5-5,0, иконцентрации 100 мкг/мл по белку, добав- концентрации пролактина равной 0 84 - 120125ляют по 0,1 мл меченого 1пролактина; нМ, использование которых позволяет по(100000 импульсов/мин)и по 005 мл немечено высить точность способа определения лакго пролактина с различной концентрацией тогенных рецепторов в молоке корок,(от 0,84 до 120 нМ), Процент специфического связывания проВ контрольной пробе (1) немеченый лактина с жировыми шариками молокапролактин отсутствует, Вместо него добав- крольчихи в способе-прототипе равен 25 ляют 0,05 мл буфера, Смесь инкубируют при 20 30. В предлагаемом решении он достигает20 С втечение 24 ч, Свободный и связанный до 43%, т.е, йа 13 - 18% выше. Влияние конс мембранами пролактин разделяют цент- центрации немеченого пролактина на сперифугированием проб, надосадочную жид- цифическое связывание меченогокость отсасывают, Радиоактивность осадка пролактина показано в табл. 2,определяют на приборе "Сотри-Оай 1 еа" 25 Следовательно, предлагаемый способ(фирма,КВ). Константу диссоциации и" кон- повышает точность и чувствительность иэцентрацию рецепторов определяют по гра- вестного способа, высокоэффективен прифику Скэтчарда методом регрессионного использовании в научных и "диагностичеанализа, в котором используют полученные ских исследования, так"как получение больданные о количестве меченого пролактина, 30 шого количества мембран жировых глобул .связанного с мембранами жировых глобул из молока коров дает возможность провомолока коров, Зная удельную активность дить параллельные исследования, повышамеченого пролактина, а также количество ющие надежность предлагаемого способа,добавленного к мембранам меченого и натив- Формула изобретенияного пролактина, вычисляют концентрации 35 Способ определения концентрациилакспецифически связанных (В) и свободных тогенных рецепторов, предусматривающиймолекул гормона (1), а также их отношение выделение мембран элировых глобул из(В/1). Представив таким образом экспери- исследуемых проб молдка с последующимментальные данные(В/1 от В, фиг, 1), мето- . рвцепторным анализом в присутствии мечедом регрессии определяют параметры 40 ного и немеченого пролактина, инкуби 12взаимодействия, На фиг, 1 пунктиром изо- рование в буфере, центрифугирование,бражена линия регресс 1 и, вычисленная по установление количества связанного меуравнению 1 с помощью определенных па- ченого пролактина по радиоактивностираметров взаимодействия. Параметры вза- полученного осадка и определение конимодействия пролактина с рецепторами 45 центрации лактогенных рецепторов в замембран жировых глобул молока коров по- висимости от установленного количестваказаны в табл. 1, связанного меченого пролактина, о т л и ч а юОбработку экспериментальных данных щ и й с я тем, что, с целью повышенияпроводят на ЭВМ с помощью программы точности и расширения функциональных"Дельта", разработанной в МГУ, 50 возможностей, выделение мембран жироКак свидетельствуют данные табл, 2, вых глобул осуществляют из исследуемыхпри концентрации добавляемого немечено- проб молока коров, причем немеченый прого пролактина боле 120 нМ обеспечивается лактин используют в концентрации 0,84 только неспецифическое связывание мече нМ, а буфер с рН 4,5-5,0.51 ббб 1 аблица 1 Константасоциа ии, нМ Таблиц Таб 3 Пример Значения рН инку ба ионного буфер пецифическоевязывание,р специфическоговязывания а 0 нижаетсязыван 6 3 4,5 4,7 4,95,0 5,2 43,0 40.5 33,0 30,0 180532 ,575 Начинается выпадение пролактина восадокНаблюдается высокое специфическоесвязывание пролактина процесс специфического1751665 90 О на соеиефицеское лияни Составительедактор А,Долинич Техред М.Моргентал Корректор Т.Вашкович Заказ 2688 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 в Ю Ю ч Щр 1 5 э нкцбационного бцр сбяэьбание с МГЭиа 2 оизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101