Способ определения активности l-лизин -оксидазы

(21) 4849 (22) 17.04 (46) 30.06 (72) В,А. (53) 577,1 (56) Авто 3 Ф 11632 (54) СПО СТИ -Л (57) Исп мацевтич на, Су содержащую, об:%; -0,8; водный раствор цией 1,46 мг/мл 0,1; льтуры гриба рода После инкубирования о вводят в нее 0,1- инола с рН 10,0-13,8, рено. 0,04 - 10,00 мг гереакционной смеси и состава устанавливаьтат оценивают люмиом; 5 ил., 1 табл. 29/1390 реакционную смесь, фосфатный буфер 0,7 Е-лизина с концентра водный экстракт ку ТпсЬодегп)а 0,1-0,2. смеси дополнительн 0,8%-ный раствор люм в 1 л которого раство мина, Соотношение люминолгеминового ют равным 1:10. Резул нометрическим метод ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ.92, Бюл. 1 ч. 24Ишутин5.08 (088.8)рское свидетельство СССР 68, кл. С 21 0 1/00, 1983.СОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНО- ИЗИН- а-ОКСИДАЗЫользование: микробиология, фареская. промышленность, медицищность изобретения: готовят Изобретение относится к энзимологиии может быть использовано при определении активности . ферментов, катализирующих в субстратах образование перекисиводорода в микробиологической промышленности, медицине. фармакологии и,других отраслях науки и техники.Активность ферментов определяют поколичеству расщепленного субстрата илиобразованию определенного количествапродукта эа единицу времени 1 мг фермента; по числу микролитров субстрата,.потребляемого (в стандартных условиях) втечение1.ч на 1 мг фермента; числом микромолейили молекул субстрата, прореагировавшегоза 1 мин на 1 мг фермента.Эти способы многостадийны и продолжительны по времени. Для их исполнениянеобходимы редкие и дорогие реактивы,специалисты, приборы и оборудование.Известен способ определения активности Ь-лизин-а -оксидаэы в культуре грибарода ТГ 1 сЬобегп)а эр. по 0.04%-ной перекиси водорода,Способ заключается в том. что фермент .-лизин-а-оксидазу получают путем культивирования штамма ТгСЬобеггла Ьаггалцгл йИа Г - 180 в 250 мл колбе с 10 г пшеничных отрубей, 7 мл 11,4%-ного йайОз, 10 мл Н 20 при 28 С в течение 14 дн. Затем в колбу добавляют 10 мл Н 20, в течение 2 ч культуру встряхивают на ЯспОтеарага 1-327. ("Ргепд" ПН Р) и отжимают через хлопчатобумажную ткань, а водный экстракт центрифугируют от спор и мицелия и определяют активность :лизин- а -оксидазы, Реакционная смесь содержит, об,% на 1 мл: 0,5 М трис - НО 15 - 30, 5 мкМ 1:лизин 50-55, 0,04%-ная пероксидаэа 4 - 5, 0;5%-ный 0-дианиэидингидрохлорид 4 - 5, водный экстракт культуры 12-20,Смесь инкубируют аэробно при 37 С 20 мин и охлаждают, Реакцию заканчивают добавлением 1 мл 0,8 Н.НС и последующим охлаждением пробы до комнатной температуры. Оптическую плотность окрашенных растворов замеряют на спектрофотометре при 540 нм, Нижняя граница чувствител ьности -0,1 нмоль, воспроизводимость+ 0,1 нмоль. За единицу активности фермента принято количество фермента, ка+ Н 02 -Ее+ Н 2 ЧРе +НО оследующие реакции НО+ Н 202-Н 20+ Н 02Н 02+ Н 02 Н 20+ 02 талиэирующего образование 1 нмоль перекиси водорода за 1 мин в стандартных условиях,Однакоэтотспособтакжесложен и продолжителен по исполнению. Используемый в реакции реактив 0-дианизидингидрохлорид является высокотоксичным веществом. Он, как и пероксидаэа, является дорогостоящим и редким веществом. Точность способа невелика, поскольку нельзя утверждать, что за время инкубирования реакция завершилась полностью.Цель изобретения - удешевление, упрощение, ускорение способа определения активности фермента, повышение его точности и безопасности для человека. Поставленная цель достигается использованием нового состава реакционной смеси, содержащей, об,о на 1 мл, фосфатный буфер 0,7 - 0,8, водный раствор :лизина концентрацией 1,46 мг/мл 0,1, водный экстракт культуры 0,1 - 0,2,Смесь инкубируют азробно при 37 С 20 мин и в нее дополнительно вводят 0,1 - 0,8 О- ный раствор люминала с рН 10,0 - 13,8, содержащий гемин из расчета 0,04 - 10 мг/л раствора люминола при соотношении реакционной смеси и люминолгеминового состава 1:10, Результат оценивают люминометрическим методом,Исключение из реакционной смеси НС 1, О-дианизидингидрохлорида, пероксидазы повышает безопасность способа для человека и удешевляет его. А использование люминолгеминового состава в смеси повышает чувствительность способа, так как люминол (5-амино,3-дигидро,4-фталазиндион) в щелочной среде в присутствии таких катализаторов, как медь, кобальт и наличие в ней перекиси водорода дает яркое свечение. Особенно резко оно усиливается в присутствии гемина, который является для перекиси водорода одним из самых сильных из всех известных в природе катализаторов, При введении в реакционную смесь люминолгеминового состава при наличии в ней переиси водорода возникает перенос электрона (гомолиз) В процессе последних реакций комбинации свободных радикалов образуются короткоживущие соединения типа ассоциированного и неассоциированного Ван-дер Ваальсовского комплексов кислорода,обладающие избыточной энергией, которая трансформируется люминолом в световую по реакции 5 Для регистрации квантов света используют анализатор, чем повышается точность определений.Диапазон эффективных концентрацийлюминала в щелочи и гемина в растворе 0 люминола определяли следующим образом.Готовили раствор люминола в щелочи(КОН) концентрацией 0,276 мг/л и на его основе готовили люминолгеминовый состав с концентрацией гемина от 0,01 до 12 мг/л 5 в растворе люминола, Готовили растворылюминола в щелочи концентрацией 0,05 - 1,0)ь и в каждом из них растворяли навески гемина из расчета его концентрации в растворе люминола 0,1 мг/л. Готовили разведе ния перекиси водорода концентрацией1-10 нмоль и с помощью анализатора проводили их аналиЗ, используя приготовленные люминолгеминовые составы. По результатам анализа строили графики в ко ординатах: величина измеряемого сигнала фФ- концентрация перекиси водорода(нмоль),Графики приведены на фиг.1 и 2,Из фиг. 1 и 2 видно, что эффективными50 концентрациями люминола в щелочи являются концентрации 0,1-0,8 О, а для геминав растворе люминала они лежат в пределахот 0,04 до 10 мг/л.Поскольку шкала анализатора не отгра 55 дуирована в единицах концентрации перекиси водорода, то ее определяли покалибровочному графику (см.фиг,3), полученному по результатам анализа разведений перекиси водорода с помощьюлюминолгеминового состава, в котором концентрация люминола в щелочи составляет 0,276 мг/л, а навеска гемина растворена израсчета его концентрации в растворе люминола,равной 0,1 мг/л.П р и м е р. Определяли активность -лизин-а-оксидазы в водном растворе культурыБрали емкость из стекла с притертой пробкойобъемом 150 мл, наливали в нее 0,15;4-ныйщелочной (рН 12,8) раствор люминола и растворяли в нем навеску гемина массой 0,04 мг 10в течение 3 мин при. комнатной температуре.В двух чистых колбах с притертыми пробкамипараллельно готовили реакционные смеси,содержащие, об, Оф на 1 мл: фосфатный буфер(рН=5,7-5,9) 0,7 - 0,.8, водный раствор 1:лизина концентрацией 1,46 мг/л 0,1, водный экстракт культуры 0,2 - 0,1,Колбы закрывали пробками и инкубировали аэробно при 37 С 20 мин, после чего в. смесях колб без охлаждения и остановки 20реакции НС определяли перекись водорода с помощью люминолгеминового составанв анализаторе. Для этого прибор подключали к источнику питания и оно подавалось.на блок 1 питания (см.фиг,4), Далее с блока .251 питания напряжение подавалось на блок .2 преобразования напряжения, откуда низковольтное напряжение подается на блок 8регистрации времени измерения и блок 7управления. Высоковольтное напряжение.30подается на блок 3 отключения напряжения, блок 4 преобразования светового сигнала в электрический,ВС подвижного стакана 19 (см.фиг.5) блока 4 преобразования светового сигнала в 35электрический снимают крышку 11, дозатор14 и из него извлекают пробирку 17. В пробирку помещают 0,1 мл анализируемой ре- .акционной смеси, устанавливают ее снова вподвижный стакан 19 и на него устанавливают дозатор 14. В полость 13 дозатора 14наливают 1 мл люминолгеминового реакти. ва, закрывают ее крышкой 11 и нажимаютна нее рукой. Под действием нажатия стакан 19 перемещается до упора вниз, где он 45фиксируется рычагом 23. При этом отверстие 16 в стакане 19 совмещается с чувствительным элементом 18 ФЭУ. Придостижении стаканом 19 упора от нажатияруки деформируется резиновая прокладка 5012 в крышке 11 и через отверстие 15 в дозаторе 14 люминолгеминовая смесь вводитсяв пробирку 17. При взаимодействии люминолгеминовой смеси с перекисью водорода,образовавшейся в реакционной смеси,в 55пробирке 17,выделяются кванты света, ко,торые ФЗУ преобразуются в электрическийсигнал, Он поступает на аналого-цифровойпреобразователь 5 (см.фиг,4), откуда поступает нв блок 6 индикации и блок 9 регистрации его внешними регистрирующими уст ройствами. Положительный эффект способаоценивали по результатам анализа перекиси водорода Концентрацией 0,01 нмоль спомощью люминолгеминовой смеси на анализаторе, По результатам анализа определяли среднеквадратическую ошибку иоценивали меру точности.Результаты анализа приведены в таблице,Истинное значение измеряемой величины сигнала лежит в интервале 0,1918 -0,788 с надежностью 0,99. За единицуактивности фермента принято количествофермента,катализирующего образование 1нмоль перекиси водорода за 1 мин в стандартных условиях, Активность фермента впервой колбе составила 1,43 ед, (14,7 ед/млэкстракта), а во второй 2,74 ед, (13,7 ед/млэкстракта). Нижняя граница чувствительности 0,01 нмоль. воспроизводимость+0,01 нмоль.Использование предлагаемого способаобеспечивает следующме преимущества:исключается использование редких, дорогих и ядовитых реактивов, что делает процесс определения активности ферментабезопасным для человека и дешевым по стоимости; повышена чувствительность способа в 10 раз; обеспечивается возможностьконтроля кинетики накопления перекисиводорода в реакционной смеси при ее инкубировании, что позволяет оценивать качество фермента; реактивы и приборотечественного производства и внедритьпредлагаемый способ в практику не составляет труда,Формула изобретения Способ определения активности :лизина-оксидазы в водном экстракте культуры гриба рода Тгейобегеа, лредусматривающий приготовление реакционной смеси, состоящей из фосфатного буфера, водного раствора :лизина и водного экстракта культуры, инкубирование ее в термостате с последующей оценкой результатов, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, его упрощения, ускорения и безопасности, компоненты реакционной смеси берут в следующем количественном соотношении, об. ;Фосфатный буфер0,7-0,8 Водный раствор 1:лизинас концентрацией 1,46 мг/мл 0,1 Водный экстракт культуры 0,1-0,2 после инкубирования в реакционную смесь дополнительно вводят 0,1-0.8-ный раствор люминола с рН.10.0-13,8, содержащий гемин из расчета 0,04-.10,0 мг/л раствора1744114 люминола, при соотношении реакционной смеси и лвминолгеминового состава 1:10, а оицентрацкя перекиси водорода, Вдоль г 1 о у результат оценивает люминометрическимметодом.1744114 К я перекиси водорода, ймо оЛ олКонцентра цб. с,перекиси во1744114 16 18 Составитель Е,ПолезаРедактор М.Недолуженко Техред М,Моргентал ректор М.Пожо Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород,ул.Гагарина каэ 2169 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5