Способ определения иммунокомпетентных клеток

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 1)5 С О 1 Б 33/53 Н 8 ТОРСНОМУ СВИ ЕЛЬСТВУ чной сиро- а с от- Е ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АНИЕ ИЗО(71) Ивановский государственный медицинский институт им, А,С.Бубнова(56) Авторское свидетельство СССРУ 364986,986,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИИИУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК(57) Способ относится к медицине изаключается в выделении суспенэиилейкоцитов крови, постановке реакций розеткообразования и фагоцитоэа,фиксации, окраске и приготовлениимазков, Целью изобретения являетсяинтенсификация способа при массовом Изобретение относится к биологиии медицине, а именно к иммунологии.Цель изобретения - интенсификацияспособа при массовом иммунологическом обследовании, увеличение количества исследуемых образцов, уменьшение ко. личества исследуемого материала и повышение точности способа - достигается тем, что на этапе восстановления осмотического давления после лизиса эритроцитов используют 1 О-кратный раствор Хенкса, содержащий 3-7 Е желатина, операции дофиксации и окраски клеточных препаратов совмещают, осуществляя их вместо равной по времени и технике исполнения операции подготовки осадка клеток к нанесению мазков (в прототипе), но вместо дистиллированной воды,.8015821 З иммунологическом обследовании, увеличение количества исследуемых образцовуменьшение количества исследуемогоматериала и повышение точности способа. Цель достигается добавлением3-7 Й желатина к 10-кратному растворуХеикса, что избавляет от загрязненияоболочками эритроцитов клеточные препараты на этапе выделения лейкоцитов,проведением окраски клеток непосредственно в суспенэии до нанесения мазков, механическим приготовлениеммазков-отпечатков одновременно и однотипно путем центрифугирования при180-400 я перевернутой многолуноемкости с пробами на плотно фикванные к ней бумажную прокладкуверстиями и прозрачную пленку, используемую в качестве препаратоносителя. к осадку приливают раствор краски,содержащий 1 О-ЗОБ метилового или этилового спирта, ресуспендируют, а мазки готовят не вручную, а механическимспособом одномоментно для всей партиипроб: планшет накрывают листом бумаги,служащей в качестве прокладки, с пробитыми в ней отверстиями, соответствующими по диаметру лункам планше-;та, заТем ацетатцеллюлозной пленкой,предварительно покрытой слоем белка,которая используется в данном случае в качестве препаратоносителя,сверху кладут крышку с поролоновойпрокладкой, которую плотно прижимают к планшету; осадок ресуспендируют, перевернутый вверх дном планшетцентрифугируют при 180-400 я 5 мин, 1582130выдерживают 20-40 мин, после чего полученные окрашенные мазки отпечаткипросушивают, промывают водои и вновьнпросушивают.Способ осуществляют следующим образом.В лунку планшета для агглютинации(объем каждой лунки 2 спи) вливают1,8 мл дистиллированной воды. 0,020,05 мл крови забирают из пальца исразу же смешивают с водой в лунке.Через 40 с в лунку приливают 0,2 мл10 кратного раствора Хенкса, содержащего 3-7% желатина, перемешивают.Центрифугируют при 150-200 я, надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 0,3 мл среды 1 99, Получают суспензию лейкоцитов, готовуюдля постановки реакции. 20В лунки планшетов для иммунологических реакций одноразового использования (объем каждой лунки 0,2 см )Эзаливают на 0,05 мл полученной суспензии лейкоцитов и равный объем 0,025%- 25ной суспензии индикаторных частиц -эритроцитов барана или мьппи, нликлеток пекарских дрожжей, убитыхнагреванием, цнтрифугируют при 200 я5 мин, инкубируют при 4-10 С 30 мин,затем к осадку приливают 0,020,025 мл раствора, содержащего 0,4%глутарового альдегида, 4% формальдегида, остальное - фосфатный буфер, ивыдерживают при комнатной температуре 10 мин. Надосадочную жидкость вы,тряхивают, а к осадку приливают0,05 мл раствора метилового зеленогопиронина или азур-эозина, содержащего дополнительно 10-30% метилового 40или этилового спирта, Затем планшетнакрывают пропитанной водой бумажнойпрокладкой с выбитыми в ней отверстиями, соответствуницими лункам планшета, сверху накладывают лист пРозрачной пленки соответствующего планшету размера стороной, предварительнопокрытой слоем белка, фиксированногометанолом, затем накрывают крьппкойпланшета, к которой снизу приклеенпоролон. Крышку плотно прижимают кпланшету при помощи резинок или зажимов, после чего осадок клеток тщательно ресуспендируют в краске. Далеепланшет переворачивают так, чтобы днолунок находилось вверху, центрифугируют при 1 80-400 я 5 мин и выдерживаютв течение 20-40 мин. Затей пленку вместе с бумагой, снимают с планшета,краске дают стечь и высушивают. Пленку с полученными мазками отделяют отбумаги, промывают водой и высушивают вновь, Полученные мазки заливают канадским бальзамом, покрывают листоманалогичной пленки и получают препараты, готовые к просчету. Предложенный способ позволяет получить на пленке одновременно 9 б мазков (по количеству лунок в планшете).Пленки к работе готовит следующимобразом,Берут лист гибкой прозрачной пленки, например ацетатцеллюлозной пленки,используемой в качестве основы при производстве рентгеновских или фотографических пластин, разрезают прямоугольники размером 9 х 12 см, при необходимости (если готовят из отработанных рентгеновских или фотографических пластин) моют и высушивают,Затем при помощи ватного или марлевого тампона наносят слой белка (сыворотки крови, раствора альбумина, яичного белка или желатина), высушивают и фиксируют, выдерживая в метиловом спирте в течение 10 мин.Способ иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1, Иэ пальца у детей в возрасте от 1 до 3 лет забирали по 0,02 мл крови. Кровь немедленно помещали в лунку планшета для агглютинации, содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, перемешивали, выдерживали 40 с. Затем приливали 0,2 мл 10-кратного раствора Хенкса, содержащего 3% желатина, перемешивали. После забора крови указанным способом у 96 детей планшеты плотно закрывали крьппками и транспортировали влабораторию (всего 4 планшета по 24 лунки в каждом), В лаборатории планшеты центрифугировали при 180в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку приливали 0,3 мл среды 199. Осадок ресуспендировали получали суспензию лейкоцитов. В лунки трех чистых иммунологических 9 б-луночных планшетов (объем каждой лунки 0,2 мл) заливали по 0,05 мл полученной суспензии лейкоцитов. По- . сле этого в один планшет приливали по 0,05 мл 0,25%-ной суспензии эритроцитов барана, в другой - по 0,05 мп 0,025%-ной суспензии эритроцитов мьппи, в третий - по 0,05 мл 0,025%- ной суспензии клеток пекарских дрож 5 158 жей, убитых нагреванием, Центрифугировали при 200 я 5 мп, инкубироалг при 6 С 30 мин. 1 .-нкп четв;ртого п,п.:мета (предварительно обработанные 0,05 мл водного раствора 0,01 М теофиллина и высушенные) приливали по 0,05 мл полученной от каждого больного суспензии лейкоцитов, планшет инкубировали при 37 С в течение 60 мин, после чего в лунки приливали по 0,05 мл эритроцитов барана (0,025 - ной суспензии), центрифугировали при200 я 5 мин и инкубировали при 6 С 30 мин, По окончании инкубации в холодильнике в лунки планшета заливалипо 0,025 мл раствора, закрепляющего розетки (0,4 глутарового альдегида, 4% формальдегида, остальное - Фосфат ный буФер). Выдерживали 1 О мин. Надосадочную жидкость вытряхивали, а к осадку приливали по 0,05 мл раствора метилового зеленого и пиронина в ацетатном буфере, в который введено10 этилового спирта. После этого каждый планшет накрывали бумажной прокладкой размером 9 к 12 см, пропитанной,водой, с выбитыми в ней отверстиями диаметром 5 мм, совпадающими с лунками планшета, сверху накладывали лист прозрачной пленки, предварительно покрытой слоем белка, размером 912 см (в качестве белка использовали сыворотку крови, раствор альбумина или белок яйца, пленку высушивали, Фиксировали в метаноле в течение 1 О мин), далее прокладывали слой поролона, крышку планшета и плотно перетягивали полученный комплект резиновыми обхватами. Затем содержимое лунок тщательно ресуспендировали постукиванием планшета. Далее планшеты переворачивали так, чтобы дно лунок находилось вверху, центрифугировали при 180 я в течение 5 мин и выдерживали в перевернутом состоянии 20 мин. После этого крышку снимали, краске давали стечь, а пленку вместе с бумажной прокладкой высушивали. Бумагу снимали, а пленку с мазками про-. мывали водой и вновь высушивали. Высушенные мазки заливали канадским бальзамом и накрывали листом аналогичной чистой пленки,Таким образом на плен -ке размером 9 х 12 см получали 96 одно - временно приготовленных препаратов, . расположение и величина которых соответствовали расположению и диаметру лунок планшета, Все 384 полученных 2130 6препарата имели хорошее качество,большинство из них не было загрязнено оболочками эритроцитов, лишь49 препаратов (12,8%) имели небольшое количество оболочек, нискольконе мешающих просчету. Плотность рас- .пределения клеток во всех мазкахбыла одинаковой - нормальной, конгло-,мератов практически не наблюдалось.Поэтому максимальные различия показателей, просчитанных в трех случай;но выбранных полях препаратов, сос- .тавляли не более 1-2 , что свидетель ствует о стабильно высокой точноСтиспособа. Общее время приготовления.всех 384 йрепаратов (центрифугирование 5 мин, выдерживание после центрифугирования 20 мин, высушивание до и Х после промывания мазков 20 мин) составило 45,мин, но из них конкретныезатраты труда составляют 10 мин, есливычесть операции, которые не требуютнепрерывной работы лаборанта (для 25 сравнения - на приготовление такогоже количества препаратов по базовомуспособу уходит 150 мин непрерывноготруда лаборанта).П р и м е р 2. У рабочих пред приятия из пальца забирали 0,03 мл. крови. Кровьнемедленно помещали влунку планшета для агглютинации, Содержащую 1,8 мл дистиллированной воды, выдерживали 40 с. Затем приливали 0,2 мл 10-кратного раствора Хенкса,содержащего 4% желатина, перемешивали.После забора крови указанным способому 96 рабочих планшеты плотно закрывали крышками и транспортировали в ла 4 п бораторию. В лаборатории планшетыцептрифугировали прп 50 я в течение. 5 мин. Надосадочную жидкость сливали,а к осадку приливали 0.,3 мл среды199. Осадок ресуспендировали, полу. чали суспензию лейкоцитов. С полученными клетками осуществляли комплекстестов розеткообразования (РО) и фагоцитоза (4 теста: Е-РО, М-РО, Д-фагоцитоза и Е-РО после инкубации клеток 50 с теофиллином; Е,М,Д-маркеры - соответственно эритроциты барана, мъппи,дрожжевые клетки) вплоть до получения осадка и вытряхивания надосадочной жидкости так же, как в примереПосле этого к осадку клеток приливали по 0;05 мл раствора метилового зеленого и пиронина в ацетатном буфере,в который добавляли 20 метиловогоспирта, После этого планшеты на 1582130крывали бумажной прокладкой размером9 У 1 2 см, пропитанной водой, с выбитыми в ней отверстиями диаметром 5 мм,соответствующими лункам планшета,сверху накладывали листы прозрачнойпленки, покрытой слоем белка (пленкуготовили так же, как в примере 1.),далее прикладывали слой поролона икрьппку, все это плотно перетягивалирезиновыми обхватами. Затем содержимое лунок тщательно ресуспендировалипостукиванием планшета, Далее планшеты переворачивали так,чтобы днолунок находилось вверху, центрифугировали при 250 я в течение 5 мин ивыдерживали в перевернутом состоянии30 мин. После этого крьппку снимали,краске давали стечь, а пленку вместе с бумажной прокладкой высушивали. Бумагу снимали, а пленку с мазками промывали водой ивновь высушивали. Высушенные мазки заливали.канадским бальзамом и накрывали, листоманалогичной чистой пленки. Таким об.разом, на прямоугольнике. пленки размером 9 х 12 см получали 96 препаратов."Все 384 полученных препаратов имелихорошее качество. Оболочки эритро. цитов наблюдались в 62 препаратах . 30(16,1%), но количество их было настолько незначительно, что они не ме-.шали просчету, Плотность распределения клеток во всех препаратах былаодинаковой - нормальной, конгломера-тов практически .не наблюдалось, Поэтому максимальные различия показателей, просчитанных в трех случайновыбранных полях препаратов, составляли не более,1-27, что свидетельствует о стабильно высокой точностиспособа. Общее время приготовления384 препаратов составило 55 мин,однако, если вычесть операции, которые не требуют непрерывной работылаборанта, то на приготовление пре.паратов уходит всего 10 мин непрерывного труда (по базовому способу -150 мин).. П р и м е р 3, У рабочих предприятия из пальца забирали по 0,05 млкрови, Кровь немедленно помещали влунку планшета для агглютинации,содержащую 1,8 мл дистиллированнойводы, перемешивали, выдерживали40 с, Затем приливали 0,2 мл 10-кратного раствора .Хенкса, содержащего7 желатина, перемешивали. После забора крови указанным способом у 96 рабочих планшеты плотно закрываликрышками и транспортировали в лабораторию. В лдборатории планшетыцентрифугировали при 200 я в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливали, а к осадку приливали 0,3 млсреды 199. Осадок ресуспендировали,получали суспензию лейкоцитов . Сполученными клетками ставили комплекстестов розеткообразования (4 теста:Е-РО, М-РО, Д-фагоцитов и Е-,РО послеинкубации клеток с теофиллином)вплоть до получения осадка и вытряхивания надосадочной жидкости так же,как в примере 1. После вытряхиваниянадосадочной жидкости к осадку приливали по 0,05 мл раствора метилового зеленого пиронина в ацетатном буфере, в который добавляли 30. этилового спирта. После этого планшетынакрывали бумажнымипрокладками размером 912 см, пропитанными водой, свыбитыми в них отверстиями диаметром5 мм (каждое отверстие должно находиться против лунки), сверху накладывали листы прозрачной пленки, предварительнопокрытой Вдоем белка (пленку готовили так же, как в примере 1),далее прикладывали слой поролона икрышки планшетов, Все. это плотно перетягивали резиновыми обхватами, Затем содержимое лунок тщательно ресуспендировали постукиванием планшета, Далее планшеты переворачивалитак, чтобы дно лунок находилось сверху, центрифугировали при 300 я в течение 5 мин и выдерживали в перевернутом состоянии 30 мин, После этогокрышку снимали, краске давали стечь,а плелку вместе с бумажной прокладкойвысушивали. Высушенные. мазки заливаликанадским бальзамом и накрывали листом аналогичной чистой пленки. Такимобразом на прямоугольнике пленки раз. -мером 912 см получали 96 препаратов,Все 384 полученных препарата имелихорошее качество. Оболочки эритроцитов наблюдали в 109 препаратах (28,4%),что связано, вероятно, с большим количеством забираемой для анализа крови(0,05 мл). Однако количество оболочекв препаратах было настолько незначительным, чтб бни не мешали просчетупрепаратов . Плотность распределенияклеток во всех препаратах была одинаковой - нормальной , конгломера-.тов практически не наблюдалось.Подробный анализ качественныххарактеристик мазков (определяющихвоспроизводимость и точность метода),а также затрат времени .на их получе 5ние для данных примеров показал следующее.Предлагаемый способ дает воэможность получать более точные конечные результаты что выражается: а) встабильной равномерно одинаковой нормальной густоте всех препаратов, в товремя как при изготовлении мазков .вручную (прототип) густота препаратовсильно колеблется и зависит, в частности, от индивидуальных особенностейи опыта лаборантов, в связи с чем102 препаратов не удается просчитатьиз-эа плохого качества мазков 1 б) в. том, что предлагаемый способ дает воз-,0можность стабильно получать препаратыбеэ оболочек эритроцитов или с небольшим количеством оболочек, практическине мешающих просчету препаратов, вто время как при использовании прототипа более половины всех препаратовбыли загрязнены оболочками эритроцитов, что в 103 случаев привело к невозможности просчета препаратов, Таким образом, данные свидетельствуюто большей точности предлагаемого способа в сравнении с прототипом.Предлагаемый способ позволяетпрактически полностью устранить конгломераты иэ препаратов, что такжеведет к увеличению точности способа,Действительно, при просчете результатов в трех параллельных пробах различия в полученных данных были по предлагаемому способу достоверно (Р (0,01)40и существенно (в 2,1-3,3 раза) ниже,чем по прототипу, что непосредственноуже свидетельствует о более высокойточности предлагаемого способа,Осуществление операций предложенного способа и подготовка к ним занимают времени в 4,4-5,4 раза меньше,чем в базовом способе (прототипе).При приготовлении препаратов предложенным способом планшет после центрифугирования выдерживают в течение 2040 мин, не затрачивая труда, в товремя как приготовление мазков вручнуюпри базовом способе требует не менее150 мин непрерывной работы лаборанта.Если учесть, что предыдущие этапы выполнения способа, включая подготовкуреактивов непосредственно перед реакцией, в предложенном и базовом способах практически совпадают и время их выполнения одним сотрудником по данным хронометража около 122 мин, то в целом на,осуществление предложенного способа идет в 2,8-2,6 раза меньше рабочего времени, чем на осуществление базового. Имеет место определенная экономия реактивов (спирта, краски) и препаратоносителя (предметных стекол) при использовании предложенного способа по сравнению с базовым.Таким образом, предложенный способ по отношению к прототипу (базовому способу) является более совершенным и точным за счет существенного улучшения качества приготовляемых препаратов, позволивших получить более стабильные и воспроизводимые результаты, благодаря очистке препаратов от оболочек эритроцитов и равномерного распределения клеток на пленке эа счет перехода с ручного труда на стандарт" ный механический способ одновременного и однотипного приготовления большого количества мазков-отпечатков, Он позволяет получить конечные ре-, зультаты в 2,8-2,6 раза быстрее, чем при использовании базового способа, что дает воэможность выполнить предложенный способ для 96 образцов крови одним сотрудником, по хронометрическим данным, приблизительно за 4- 4,5 ч рабочего времени.Точность и краткость выполнения предложенного способа, простота и доступность его для, всех лабораторий выводит комплекс микрометодов розеткообраэования и фагоцитоза на качественно новый уровень - возможности практического применения для массовых обследований населения,В связи с иэложенйым можно рекомендовать широкое внедрение способа при массовых иммунологических исследованиях населения (не менее 96 человек за 4-5 ч рабочего времени), исиспользование его не только в научных лабораториях, но и во всех практических клинических лабораториях для оценки иммунного статуса человека.Способ полностью готов к внедрению, прост в исполнении, дешев, нетрудоемок, точен, краток во времени, требует миндального количества дешевых и доступных .реактивов и оборудования.5821 Составитель П.Бонарцев Техред Л.Олийнык Корректор И.Самборская Редактор А. Маковская Заказ 2086 Тираж 512 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям прн ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 формула и з о б р е т е н.и яСпособ определения иммунокомпетентных клеток, включающий отделение лейкоцитов от гемолизированных эритроцитов, смешение лейкоцитов с индикатор 5 ными частицами в лунках планшета, центрифугирование смеси, Фиксацию клеток, приготовление мазков клеток, их окрашивание с последующим учетом иммунокомпетентных клеток, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цепью , интенсификации способа при массовом .иммунологическом обследовании, увеличения количества исследуемых ОЕВашЮв,15 30 12уменьшения количества исследуемогоматериала и повышения точности способа, отделение лейкоцитов от гемолизироэанных эритроцитов проводятпри центрифугировании в соленом растворе в Э"73 желатина, окрашиваютосажденные клетки после фиксации, амазки клеток приготавливают на поверхности пленки с белковым покрытиемв процессе центрифугирования планшетас ресуспендированными в лунках, фиксированными окрашеннымй клетками и ихосаждения из лунок на поверхностьпленки.