Способ приготовления эритроцитов

ОП И ЙЗОБ Юонз Советски Сониалистических Республик(71) Заявитель Уфимски учно-исследовательскии институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова 4) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТО меди- пропутем гиче- лини- отоввляется повышеощей способности м ра - 9,2 аство - 5,7 и м же зом.Свежие одснныс 1:1выдерживаформалидхолодильпи ур, разве- раствором,растворомобычном эритроциты когическимпо объемуие 3 сутокм приступают мытые физио.тс 200 в течсн е. Затс Отмыв Изоорстснис относится к ооласти цискойроленности, а имено к пзводству вирусных препаратов.Известен способ приготовления эритроцитов для адсорбции вируса гриппа отмывания эритропитов кур физиоло ским раствором сослсдующей форма зацией, пов.орным отмыванием и приг лснием суспснзии эритроцитов 1.Однако известный способ не обеспечивает высокой адсорбционно-элюирующей способности эритроцитов.Целью изобретения яние адсорбционно-элоируэритроцитов.Эта цель достигается тем, что формалипизированныс эритроциты отмывают двукратно боратпо-фосфатным буферны створом хлористого натрия при рН 9, и однократно фосфатным буферным р ром хлористого натрия при рН 5,5 суспснзию эритроцитов готовят в это растворс.Способ осуществляют следующим обраке их па лабораторнои рефрижераторнои центрифуге ЦЛР- в стеклянных цснтрпфужных стаканах емкостью 250 мл. Центрифугировапие на всех этапах проводят со скоростью 1000 об/ не более 4 - 5 мин. Эти условия выбирают для того, чтобы не допустить попадания в осадок формалинизированных эритроцптов разрушенных клеток и прочих примесей, оседающих при длительном и скоростном центрифугированпи и способных загрязнить вируссодержащий материал нд этапе элюции. Послсдовдтсльность промывания формалинизированных эритроцитов следующая.После удаления формалина эритроциты дважды промывают физиологическим раствором рН 7,0. Затем дважды их центрифугируют в щелочном бор атно-фосфатном растворе хлористого натрия рН 9,0. Прп этом в промывной жидкости методом определения белка по Лоури обарусвается от 0,8 до 1,1 мкг его в 1 мл, тогда как после отмывки эритроцитов обычным физиологическим раствором рН 7,0 примесей белка не обнаружено.Далее осадок формалинизпрованных эритроцтов промывают на центрифуге ЦЛРоднократно фосфатно-буферным раствором хлористого натрия р 11 5,6 и рссуспсндиру3 10 15 20 25 30 35 045 50 Малотина Составитель С. Редактор М. Диитриева Текрсд С. Лнт;пенно Корректоры: Т. Добровольскаяи А. Степанова Заказ 83/5 Изд.196 Тираж 680 Подписное НПО Государств;нного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, К, Раушская паб., д. 4/5ГииоГР 7 ия, пр. Сапунова, 2 ют цх В равном количестве )ого же раствора до получсРя 50% по объему взвеси.,ЛЯ ГОЛУС.Ц 5 0(111 ЦС 1 Ц 10 ГО И КОЦП;ЦТРИрованного Вируссодержащ го ма,сриала на ка)Дыс 100 м, ал)7 ГГ)ценой жцДкости ДО- бавл 5 пот 6 мл 50%-цо.; взвеси эритроцитов и остаплапот для адсорбпц вируса в холодилнике цри 4 С па 1:оь. На другой день осадок формалин цзцровапных э )цтроцитов с Рагру)ксРПым гцруссо цсцтрифугируют на ЦЛРпрц 1000 об/миц в течение 5 мин, затем Одокр 2 Гцо промь 1 В 210 т Охл 2)кдсцным до 4 - 6 физиологическим раствором рН 7,0 и помещают на элоцшо вируса в водяную беио при 38 С в физиологичсском растворе, объем которого в 10 раз меньше объема исходноц аллаитоисной жидкости (десятикратпьй элюат). Через 4 ч выдержпвация в водяной бане взвесь эритроцитов центрифугируют на ЦЛРпри 2000 об/мцн в течение 15 - 20 мцц, надосадочную жидкость (1 элюат) сливают и ПОВторяот цкл элюциц В течение 3 1 в таком )кс объеме ризиологического раствора. Степень элюци 11 определяют в реакции гемаггл:Отицации (РГА) с 1%-ной взвесью све)кцх эрцтроцитов кур на плсксиглазовых дощепсах. Об.см реакции в каждой лунке составляет 1 мл. Для сравнения процесс адсорбциц и дв цикла элюции того те вируса проводят с формалицизированнымц эритроцитами, приготовленымп общсцзвсстцым способом (без промывания их щелочным и кцсльм буферными растворами).Как показали )сзул.тать ПЫЖОВ, прР использовании 01 щеппь 1 х формалинизированиьх эритропцтов, приготовленных по предлагаемому способу, процесс десорбциц вируса происходит быстрее. Так, уже через 2 ч вьдср)кивапия в водяцой бане вируса Л (Виктория) 75 элоировало в физиологический раствор от 76 до 81% по сравнению с гсмагглотпнирующсй активностью в аллантоисной жидкости с учетом небольших потерь после адсорбцци Вируса на эритроцитах. При использовании формалинизироВае 1 ных эрцГроцц 70 В, приготОВлсцных ОощеРзвсстым сособом, за этот период элОИ- ровало от 22 до 30%. Через 4 ч (1 цикл элюции) в первом сл) ас освобождалось от 83 до 85%, а во втором - от 40 до 43% . В конечцом итоге за два цикла элоции (7 ч Выдери,ипапц 1 Г) ВОДИВ 01 баит) 01 ццсець 1 с формалццизцровацныс эритроциты освооождали 07 - 8.",) адсорбированпого са, 1 эрцтроиты, 1 рцготов;еРньс ю Общеизвестному способу, - 43 - 46% по сравнению с содержанием гемзглютинипов аллацтоисцой жцдкост 1, Вычцслнных ца 00- цРР 0507 см )атсриал 2. Дл 5 сцяти 51 ОстаВ- шсгося вцруса Во втором случае потрсооВалось проведение третьего и четвертого этапов э;поированця вируса, т. с. дополнитслцос выдерживание в вод 5 ной бане 6 - 7 ч, что удлцняло процссс приготовления очип 1 спного вируссодержащего материала, приводя к потерям гсмагглютинцрующсй активности па этапах.Использование предлагаемого способа ООЕСЦЕсИВВСТ УСКОРЕНИЕ ПРОЦСсса ПРИГОТОВ- лсция элюатов вируса гриппа с высокой адсорбционпо-эл:оцрующсй способностью, что очень ва)кно для сокращения технологического процесса изготовления инактивировац;ой грцццозцой вакццць, а также сниженс потеой гсмагглютицир ющей активности при очистке вируса методом адсорб- ЦИИ-ЭЛ 10 ЦРИ С ЭРРТРОИ 7 ОВ КУР, ЧТО ИМЕЕТ особое значснцс прц использовании в про,зводствс вакцины штаммов с низкой репродуцирующсй способностью ц низким Выхо.ом гемгг 7:от иион. Формула изобретен ц яСпособ пршотовлсция эритроцитов дляадсорбции Вируса гриппа путем отмыванияэрцтроцитов кур физиологическим раствором с последуощей формалинизацией, повторным отмьшапцем и приготовлениемсуспензии эритроццтов, отл ич а ю щи йс ятем, что, с целью повышеия адсорбциоцно-элюирующей способности эритроцитов,формалицизированцые эритропиты отмывают двукратно боратно-фосфатным буферным раствором хлористого натрия при рН9,0 - 9,2 и одцократ)о фосратным буферным раствором хлористого натрия при р 1-"5,5- - 5,7 и суспсцзио эрцтроцптов готовяти этом жс растворе.1 сто 1 цкц цнфор)12 Ции,поинять)с во внцмацце при экспертизе1. Регламент производства противогриппозцой сьиороткц с сульфаниламидами.ЛспНИИВС им. ЧсИРкова, 1966.