Способ получения иммобилизованной микробной инвертазы для гидролиза сахарозы

Лизация.,инвертазы, проводится непрерывный гидролиз сахарных сиропов стой же концентрацией (50-70%) притой же температуре (40-60 С), причемсахарные сиропы подаются в реакторс противоположным направлением движения жидкости по сравнению с проведением процесса иммобилизации, Послеснижения скорости гидрлиза опятьпроводится процесс активации иммобитнзованной инвертазы глутаровым альдегидом в тех же условиях с последующей иммобилизацией нового слоя инвертазы и ее стабилизацией глутаро-,вым альдегидом, аналогично описанному вьппе. Этот процесс повторяют дотех пор, пока активность иммобилизованной инвертазы не достигнет требуемого уровня. Процесс иммобилизации и активации иммобилизованногоФермента проводят с противоположнымнаправлением движения жидкости посравнению с процессом гидролиза, После этого для проведения процесса гидролиза сахарозы опять меняют направление потока жидкости и т.д.Проведение процесса иммобилизации инвертазы в вьсококонцентрированном растворе сахарозы при повышенной температуре (условия процессагидролиза сахарозы ) позволяет химически зафиксировать Фермент в акти,вированном состоянии, что существенно повьппает его активность и термо 35стабильность,Применение предложенного способапозволяет увеличить выход иммобилизованной инвертазы от 38-39 до 4772 , а также повысить термостабильность иммобилизованного Фермента на20-39 .Способ иллюстрируется следующимипримерами,П Р и м е Р 1. К 10 г силохрома 45Сдобавляют 25 мл 5 -ного водногораствора у-аминопропилтриэтоксисилана, перемешивают и оставляют на 30 минпри комнатной температуре, затемизбыток жидкости сливают, а силоь 50хром прогревают при 120 С в течение8 ч, Полученный модифицированныйсилохром промывают водой до исчезновения остатков силана и высушиваютпри 60 С. Содержание аминогрупп -550 37 мг экв/г носителя. 1 г сухогоЭмодифицированного силохрома помещаютв стеклянную термостатированную ко. - .лонку, соединенную с перистальтическим насосом. Через колонку в,течение 1 ч прокачивают 10 мл 2,5 -ного (0,25 мл/г носителя) водного раствора глутарового альцегида при 20 С. В течение всего процесса иммобили" зации подача жидкости в колонку осуществляется сверху вниз со скоростью 5 мл/мин., Избыток глутарового альдегида отмывают водой. В качестве фермента используют грибную инвертаэу инвертаваморин П 10 х с активностью 4000 ед./г. Через колонку в течение 2 ч пропускают раствор, состоящий из 1 мл водного раствора грибной инвертазы с активностью 450 ед./мл и 10 мл 67 .-ного раствора сахарозы в воде, при 60 С. Полученный препарат промывают водой. Активность иммобилизованной грибной инвертазы составляет 302 ед./г носителя (67 от исходной активности Фермента, взятого для иммобилизации), С целью активации поверхности иммобилиэованного Фермента и повьппения его стабильности через колонку пропускают в течение 30 мин при 20 С 10 мл 2,5 Х-ного водного раствора глутарового альдегида (0,25 г/г носителя), На этой стадии заканчивается получение однослойной иммобилизованной инвертазы. После промывки водой активность однослойного активироваиного и стабилизированного фермента составляет 324 ед./г носителя (72% от активности исходного фермента).Для нанесения второго слоя инвертазы через колонку с препаратом снова пропускают раствор, состоящий измл грибной инвертаэы с активностью 450 ед./мл и 10 мл 67%-ного раствора сахарозы в воде, в течение 2 ч при 60 С. Полученный препарат промывают водой, активируют и стабилизируют его поверхность пропусканием через колонку 10 мл 2,5%-ного водного раствора глутарового альдегида (0,25 г/г носителя) в течение 30 мин при 20 С. Активность двухслойной иммобилиэованной инвертазы составляет 584 ед./г носителя (58 от активности фермента, взятого для получения второго слоя иммобилизованного Фермента).В тех же условиях проводят иммобилизацию третьего и четвертого слоев инвертаэы. Активность трехслойного фермента 813, четырехслойного - 1025 ед./г, что составляет соответ-5 15 ственно 51 и 477 от активности фермента, взятого для получения каждого из слоев, или 577 от общей активности инвертазы, пошедшей на все четыре слоя иммобилиэованного фермента, После тщательной промывки водой колонка с многослойной иммоби-: лизованной инвертазой готова для про ведения процесса гидролиза сахарозы.П р и м е р 2. Используют иммобилизованный фермент, полученный в примере 1. Процесс гидролиза саха- розы проводится в той же колонке1 что и процесс иммобилизации, однако сахарный сироп подается в колонку не сверху вниз, а снизу вверх. Процесс гидролиза сахароэы проводится в тех же условиях, что и процессоиммобилизации; при 60 С и концентрации сахарозы 677. Скорость подачи сиропа, необходимая для 1007.-ного гидролиэа сахароэы,3 мл/ч. После того, как скорость подачи сиропа, необходимая для достижения 1007-ного гидролиэа, снижается до 2,1 мл/ч, проводится процесс восстановления активности колонки. Для этого колонка с иммобилиэованным ферментом опять промывается водой, причем направление потока жицкости меняется на подачу растворов сверху вниз. Активность иммобилиэованного Фермента составляет 724 ед,/г. В условиях примера 1 проводят повторную активацию четырехслойной иммобилизованной ицвертаэы водным растворам глутарового альдегида и иммобилизацию пятого и шестого слоев Фермента. Активность пятислойной иммобилиэованной инвертаэы 950, шестислойной 1097 ед./г. После достижения требуемого уровня активности направление потока жидкости опять меняется на противоположное, а на колонке в тех же условиях проводится гидролиз сахароэы.П р и м е р 3. Для иммобилизации используют модифицированный силохром, полученный по примеру 1, Активацию силохрома, иммобилизацию слоев грибной инвертазы, их активацию, стабилизацию и гидролиэ сахарных сиропов проводят аналогично примерам 1 и 2. Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированно- го силохрома, соединенной с перисталь. тнческим насосом. Количество слоев иммобилизованной грибной инвертазы . 64186 6равно 5. Активность Фепмецта, добавляемого для получения каждого слояиммобилиэованной инвертаэы,450 ед.Скорость подачи раствсров в процессе 5 иммобилизации 3 мл/ ин, поток жидкостч направлен с;,эу вверх. Времяпроцесса иммобилизации на каждой стадии 3 ч, температура 40 С, концентрация сахарного сиропа 50 ь. Время обработки глутаровьв" альдегидом цля активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии 1 ч темпераотура 5 С, концентрация 1,5 г/г носителя (15 Е-ный водный раствор). Активность однослойной грибной инвертазы 308, двухслойной - 556, трехслойной - 747, четырехслойной972 и пятислойной - 11". 8 ед,/г носи теля, что составляет 537 от общейактивности фермента прошедшего навсе пять слоев иммобилиэованной грибной ицвертазы.Процесс гидролиза сэхароэы про водится в тех же условиях, что и процесс иммобилизации - при 40 С и концентрации сахарозы 507, Подача жидко:тц в колонку осуществляется сверху вниз, скорость подачи сиропа, не эбходимая для 1003-ного гидролиэасахароэы, 3,2 мл/ч. После того, какскорость .подачи сиропа, необходимаядля достижения 100 -ного гидролиза,снижается до 2,5 мл/ч, проводится 35 про, сс восстановления активностьиммабилизованного фермента в тех жеусловиях, что и процесс иммобилизации (аналогично примеру 2). В результате число слоев иммобилизованной 4 О инвертаэы увеличивается с 5 до 6, аактивность с 938 до 1140 ед,/г носителя. Затем на колонке опять проводится процесс гндролиза сахароэы втех же условиях.45 П р и м е р 4. Для иммобилизациииспользуют модифицированный силохром,полученный по примеру 1, Активациюсилохрома, иммобилизацию слоев грибной инвертазы, их активацию, стабили зацию и гидролиз сахарных сироповпроводят аналогично примерам 1 и 2.Все процессы проводят в стекляннойколонке с 1 г сухого модифицированно. го силохрома, соединенной с перисталь.тнческим насосом. Количество слоевиммобилизованной грибной инвертазыравно 4. Активность фермента, добавляемого для получения каждого слоя иммобилизованной инвертазы, 450 ед.Скорость подачи растворов в процессеиммобилизации 4 мл/мин, поток жидкости направлен сверху вниз, Время процесса иммобилизации на каждой стадии0,5 ч, температура 60 С, концентрация сахарного сиропа 70%. Время обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии 0,5 ч, температура 25 С, концентрация 0,05 г/гносителя (0,5%-ный водный раствор),Активность однослойной грибной.инвертазы 318, двухслойной - 562,трехслойной - 752 и четырехслойной -954 ед./г носителя, что составляет53% от общей активности Фермента,пошедшего на все четыре слоя иммобилизованной грибной инвертазы.Процесс гидролиза еахарозы проводится в тех же условиях, что иопроцесс иммобилизации: при 60 С иконцентрации сахарозы 70%. Подачажидкости в колонку осуществляетсяснизу вверх, скорость подачи сиропа, 25необходимая до 100%-ного гидролизасахарозы, 2,8 мл/ч. После сниженияскорости 100%-ного гидролиза до1,9 мл/ч проводится процесс восстановления активности иммобилизованнойинвертазы в тех же условиях ,что ипроцесс иммобилизации ( аналогичнопримеру 2), В результате число слоевиммобилизованной инвертазы увеличивается с 4 до 6, а активность - с647 до 921 ед./г носителя. Затемна колонке опять проводится процессгидролиза сахарозы в тех же условиях,П р и м е р 5. Для иммобилизациииспользуют модиФицированный силохром,полученный в примере 1. Активациюсилохрома, иммобилизацию слоев грибной инвертазы, их активацию, стабилизацию и гидролиз сахарных сироповпроводят аналогично примерам 1 и 2.Все процессы проводят в стекляннойколонке с 1 г сухого модиФицированного силохрома, соединенной с перистальтическим насосом, Количество слоевиммобилизованной грибной инвертазыравно 3. Активность Фермента-, добавляемого для получения каждого слояиммобилизованной инвертазы, 450 ед.Скорость подачи. растворов в процессеиммобилизации 2 мл/мин, поток жидкости направлен сверху вниз. Времяпроцесса иммобилизации на каждойстадии 5 ч, температура 70 С, концентрапия сахарного сиропа о.% в Вре мя обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии 2 ч, температура 25 С, концентрация 2 г/г носителя (20%-ный водный раствор), Активность однослойной грибной инвертазы 144, двухслоинои - 22, трехслойной - 356 ед,/г носителя, что составляет 26% от общей активности Фермента, пошедшего на все три слоя иммобилизованной грибной инвертазы.Низкая активность иммобилизопанного Фермента объясняется термоинактивацией грибной инвертазы в ходе процесса иммобилизации, которую не предотвращает даже высокая концентрация субстрата, а также инактивирующим действием высокой концентрации бифункционального реагента - глутарового альдегида.Процесс гидролиза сахарозы прово-. дится в тех же условиях, что и процесс иммобилизации: при 70 С и концентрации сахарозы 70% Подача жидкости в колонку осуществляется снизу вверх, скорость подачи сиропа, необходимая,цля 100%-ного гидролиза сахарозы, 1,1 мл/ч, После снижения скорости 100%-ного гидролиза до 0,7 мл/ч проводится процесс восстановления активности иммобилизованнойинвертазы в тех же условиях, что и процесс иммобилизации (аналогично примеру 2). В результате число слоев иммобилизованной инвертазы увеличивается с 3 до 4, а активность - с 227 до 332 ед/г носителя. Затем на колонке опять проводится процесс гицролиза сахаровы в тех же условияхП р и м е р 6. Для иммобилизации используют модиФицированный силохром, полученньй по примеру 1, Активацию силохрома, иммобилизацию слоев грибной инвертазы, их активацию, стабилизацию и гидролиз сахарных сиропов проводят аналогично .примерам 1 и 2. Все процессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модиФицированного силохрома, соединенной с перистальтическим насосом, Количество слоев иммобилизованной грибной инвертазы равно 3. Активность Фермента, добавляемого для получения каждого слоя иммобилизованной инвертазы, 450 ед. Скорость подачи растводобавляемого для получения иммо"или.с .ванного фермента, 3780 ед. Скзрост,.подачи растворов в процессе иммобилизации 5 мл/мин, поток жидкости направлен снизу ннерх. Время процесса иммобилизации 2 ч, температура 45 ",концентрация сахарного сиропа 557Время обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии30 мин, температура 15 С, концентрация 0,30 мг/г носителя (ЭЖ-нь.й водный раствор ). Активность однослойнойдрожжевой инвертазы 2020 ед./г носителя, что составляет 53% от активности фермента пошедшего на иммобилизацию,Процесс гидролиза сахароэы проводится в тех же условиях, что и про вцесс иммобилизации: при 45 С и концентрации сахарозы 55%. Подача жидкости в колонну осуществляется сверху вниз, скорость подачи сиропа, необ.ходимая для 1007-ного гидролиза сахарозы, 6 мл/ч, После снижения скорости 100%-ного гидролиза до 4 мл/чпроводится процесс восстановленияактивности иммобилизованной инвертазы в тех же условиях, что и процессию.обилизации (аналогично примеру 2),В результате число слоев иммобилизо-:ванной инвертазы увеличивается с1 по 2, а активность - с 1350 до3260 ед./г носителя, Затем на колонке опять проводится гроцесс гидролиза сахарозы в тех же условиях со скоростью 9,5 мл/ч, После снижения скотрости 1007-ного гидролиза до 7 мл/чопять проводится процесс восстановления активности иммобилизованной инвертазы в тех же условиях, в результате чего число слоев увеличивается до 3, а активность меняется с 2400 до 4360 ед,/г носителя, после чего на колонке опять проводится процесс гидролиза сахарозы,П р и и е р 8. Для иммобилизации используют модифицированный силикагель, полученный по примеру 7. Активацию силикагеля, иммобилизацию слоев инвертазы, их активацию и стабилизацию и гидролиз сахарных сиропон проводят аналогично примерам 1 и 2.Все процессы проводят в стекляннойколонке с 1 г сухого модифицированного силикагеля, соединенной с перистальтическим насосом, Препарат состоит из 4 слоев иммобилизованных ин 9 1564186 10рон в проце се иммобилизации 5 мл/минпоток жидкости направлен сверху вниз.Время процесса иммобилизации на каждой стадии 45 мин, температура ЗООС,концентрация сахарного сиропа 40%,Время обработки глутаровым альдегидом дпя активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии45 мин температура 25 С концентраУ10ция 0,025 г/г носителя (0,25%-ныйводный раствор). Активность однослойной грибной инвертазы 165, двухслойной - 282, трехслойной - 392 ед./гносителя, что составляет 197. от общейактивности Фермента, пошедшего нансе три слоя иммобилизованной грибной инвертазы,Низкая активность иммобилизованного фермента объясняется низкой концентрацией глутароного альдегида ивысокой вязкостью сахарозы при 30 С.Процесс гидролиза сахарозы проводится в тех же условиях, что и процесс,оиммобилизации: при 30 С и концентрации сахарозы 40%. Подача жидкостив колонку осуществляется снизу вверх,скорость подачи сиропа, необходимаядля 1007-ного гидролиза сахарозы,0,7 мл/ч. После снижения скорости100 -ного гидролиза до 0,5 мл/чпроводится процесс восстановления активности иммобилизованной инвертазыв тех же условиях, что и процессиммобилизации (аналогично примеру2), В результате число слоев иммоби 35лизованной инвертазы увеличиваетсяс 3 до 4, а активность с 280 до365 ед./г носителя. Затем на колон-.ке опять проводится процесс гидролиза сахарозы в тех же условиях.П р и м е р 7. Для иммобилизациииспользуют модифицированный силикагель МСА, полученный по методике примера 1. Количество аминогрупп 0,32 мг-экв/г носителя. Всепроцессы проводят в стеклянной колонке с 1 г сухого модифицированногосиликагеля, соединенной с перистальтическим насосом. В качестве фермента использовали дрожжевую инвертазумарки А /Олайне/ с активностью100000 ед./г. Активацию силикагеля,иммобилизацию слоев дрожжевой инвертазы, их активацию, стабилизациюи гидролиз сахарных сиропов проводятаналогично примерам 1 и 2. Число сло-,ев иммобилизованной дрожжевой инвертазы равно 1. Активность фермента,Ъ1156418 вертаз. Б первом и третьем слоях находится дрожжевая инвертаза, во втором и четвертом " грибная инвертаза. Активность Фермента, добавляемогс для получения слоя дрожжевой инвертязы, 3780 ед, для получения слоя грибной инвертазы - 450 ед. Скорость подачи растворов в процессе иммобилизации 3 мл/мин, поток жидкости направлен сверху вниз, Время процесса иммобилизации на каждой стадии 2 ч, температура 50 С, концентрасция сахарного сиропа 67%. Время обработки глутаровым альдегидом для активации сорбента и стабилизации препарата на каждой стадии ЗО мин, тем пература 20 С,концентрация 0,2 г/г носителя (2%-ный водный раствор). Активность однослойной иммобилизо-, 20 ванной инвертазы 2180, двухслойной 2460, трехслойной - 4380, четырехслойной - 4630 ед./г носителя, что составляет 55% от общей активности Фермента, пошедшего на все четыре 25 слоя иммобилизованного Фермента.Процесс гидролиза сахарозы проводится в тех же условиях, что и проо цесс иммобилиэаци,: при 50 С и концентрации сахарозы 67%. Подача жидкости в колонку осуществляется снизу вверх, скорость подачи сиропа, необходимая для 100%-ного гидролиза саха- розы, 13,5 мл/ч. После снижения ско 35 рости 100%-ного гидролиза до 8,0 мл/ч проводится процесс восстановления активности иммобилизованной инверта. -12Таким образом, использоваие предложенного изобретения позволяет значительно увеличить выход иммобилизованной инвертазы (с 38-39% до 47- 72% 1, а также повысить термостабильность иммобилизованного Фермента на 20-39%.Формула изобретен я1, Способ получения иммобилизванной микробной инвертазы для гидролиза сахарозы, включающий модиФикацию кремнеземных;. сорбенто:а органосила./ном. активацию сорбентов глутаровым альдегидом, связывание первой пор;ии инвертаэы с активированными сорбентами, активацию иммобилизованной инвертазы глутаровым альдегидом, связывание второй порции инвертазы и многократное повторение активации глутаровым альдегидом и связывания следующих порций инвертазы, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода иммобилизованной инвертазы и повышения ее термостабильности, связывание инвертазы про.- водят при 40-60 С в присутствии 50- 70%-ного раствора сахарозы, а после связывания последней порции инвертазы проводят дополнительную обработку глутаровым альдегидом.2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что связывание инвертазы сорбентом проводят в том же реакторе, в котором осуществляют гидролиэ сахарозы, причем оба процесса проводят в противотокеФермент Сохранение активности эы в тех же условиях, что и процесс иммобилизации (аналогично примеру 2), причем вначале проводится иммобилизация дрожжевой инвертаэы, а сверху - иммобилизация слоя грибной инвертазы. В результате число слоев иммобилизованной инвертаэы увеличивается с 4 до б,а активность- с 740 до 4910 ед./г носителя, Затеи на колонке опять проводится процесс. гидролиза сахарозы в тех же условиях,Ниже приведены данные по термостабильности препаратов иммобилизованных инвертаз Стабильность определяли по сохранению активности (в процентах) при хранении препаратов в 0,05 М ацетатном буФере с рН 4,7 при 60 С в течение 3 ч. Препараты с индексами возле номеров получены восстановлением активности препаратов после процесса гидролиза сахарозы. По известному способу123За44 а55 а6ба77 а7 б88 а 42 75 76 73 71 7278 76 80 81 64 61 63 69 68