Способ культивирования вируса гриппа

/0,2 мл) рассчитывают по результатамГА методом Кербера в моцификации,Ашмарина, после чего вычисляют дозызаражения, соответствующие исполь 5зованным разведениям вирусаРезультаты титрованияприведены в табл.1.Для последующего пассажа раздельно собирают вируссодержашую аллантоисЙую жидкость (ВАЖ) из РКЭ, зараженНых последним разведением, обеспечиВающим учитываемую репроцукцию вируса (10), а также ВАЖ с отрицательНой РГА (разведения исходного материала 10и 10)5ТТ пассаж на РКЭ. Отобранные 3 образца ВАЖ разводят с шагом 10 физиологическим раствором, содержащим указанные добавки. 0,2 мл каждого разведения заражают 3 параллельные партии РКЭ, которые инкубируют в течениео20 ч при 36 С. Далее определяют нали-чие вируса в РГА. Результаты приведены в табл,2,для последующего пассажа раздельно собирают ВАЖ из РКЭ, зараженныхразведением, которая при наименьшемсодержании вирусных частиц обеспечивает репродукцию вируса, определяемуюв РГА. Таковым материалом являетсяВАЖ, полученная после заражения в 1пассаже дозой 0,003. Дпя 111 пассажа-1отбирают ВАЖ из разведений ряда: 1010 , 10 и 10 (первое из этихразведений является минимальным с35положительной РГА, а остальные характеризуются отрицательной РГА).111 пассаж на РКЭ. Отобранные4 образца ВАЖ разводят с шагом 10указанным раствором. 0,2 мл каждогоразведения заражают 4 параллельныепартии РКЭ, которые инкубируют в течение 22 ч при Зб С. Затем определяют наличие вируса в РГА. Результатыпредставлены в табл.З,45В качестве посевного материаладля накопления вируса используют виус 1 Т 1 пассажа, полученный в результате,заражения наименьшей дозой,еще обеспечивающей репродукцию вируса, определяемогоявРГА.Таковым материалом являетсяВАЖ, полученнаяпосле заражения дозой 0,6 ЭИД /0,2 мл.5 оНакопление вируса, Посевной материал помещают в холодильник прио 55+4 С на 18 ч. Этот срок необходимв используемом в данном примере варианте заражения РКЭ на стадии накопления вируса наперед заданной дозой(возможен вариант проведения стадии накопления без определения заражающей дозы), В период хранения ВАЖ в холодильнике производят титрование ее пробы дпя установления инфекционной активности. В данном примере посевной вирус, используемый для "накопления имеет инфекционную активность 103 ЭИД в 0,2 мл.Для накопления вируса партию 10- 1-дневных РКЭ заражают дозой 10 .1 ИД,/0,2 мл и инкубируют в течение 24 ч при 36 С. Получают целевой продукт - ВАЖ с инфекционной активностьюо,10ЭИД,/0,2 мл и обратным титром в РГА 512. Индекс ИА/ГА = 10:512= = 1 О".Контроль, Для контроля пассирование данного вируса проводят 3-кратно) при той же температуре и экспозиции по 48 ч с использованием заражающей дозы 1-3 ЭИД /0,2 мл с последующим,накоплением вируса в том же режиме при заражающей дозе 10 ЭИД/0,2 мл. Получают ВАЖ с инфекционной активностью 10и обратным титром в РГА 2048,9 оИА/ГА = 10 з:2048 = 10что существенно ниже, чем в предлагаемом способе.Для контроля проводят также седиментационный анализ целевых продуктов, полученных по прототипу и по данному примеру. Вирусная популяция, полученная по прототипу, гетерогенна. Вирусная популяция, полученная предлагаемым способом, гомогенна и состоит из стандартного (инфекционного) вируса, т.е. вируса, не содержащего ДИЧ,П р и м е р 2, Полученные биомассы вакционного штамма вируса гриппа А/Техас/1/77 а/НЗБ 2/.Маточный лиофилизированный вирус указанного штамма трехкратно пасснруют на РКЭ при кратности разведений заражающего материала с шагом 10, Для последующих заражений при пассировании отбирают ВАЖ ближайших двух разведений с отрицательной РГА после разведения, использование которого давало положительную РГА (как описано в примере 1), Пассирование проводят при температуре 35 С и экспозициях 18, 20 и 24 ч (заявляемый режим экспозиции), а также 16 и 30 ч (запре дельные режимы).Стадию накопления вируса проводятопри 35 С в течение 20 ч с использованием заражающей дозы 100 ЭИЩО /0,2 мл,бирают ВАЖ нз эмбрионов, еще содержащих вирус па данным РГА в последнем разведении Эту ВАЖ используют в качестве посевного материала на стадии накопления вируса. Ей соответствуетФдоза заражения предшествующего разведения 0,01 ЭИД, /0,2 мл.В данном примере для П 1 пассажа используют в качестве эаражакицего матерюла ВАЖ 11 пассажа с положительной РГА при минимальной дозе заражения в укаэанном пассаже. Поэтому экспозицию 111 пассажа устанавливают равной 8 ч.В качестве посевного материала для накопления вируса используют ВАЖ 111 пассажа, полученную в результате заражения дозой, еще обеспечивающей репродукцию вируса, учитываемую в РГА,Стадию накопления вируса проводят как в примере 1, Получают целевой продукт с инфекционной активностью ИА10ЭИД о/0,2 мл и ГА = 512, Следовательно1 я (ИА:ГА) =0,8 1 д 512 = 8,1, В табл. приведены сравнительные данные технических характеристик целе. вых продуктов, полученных по предлагаемому способу и прототипу, Этиданные систематизированы по результатам 50 испытаний каждого из способовна указанных штаммах вируса гриппа,При этом для предлагаемого способаобобщены выходные данные различныхрежимов его осуществления,Формула изобретения 40Способ культивирования вирусагриппа путем многоциклового пассиронания, вычисления инфекционной активности вируса и .последующего накопления вируса в развивающихся куриных эмбрионах, о т л и ч а ю щ и й -с я тем, что, с целью снижения количества дефектных интерферирующихчастиц н вирусной популяции и поньшее ния ее инфекционной активности, в каждом последующем цикле пассиронанияэмбрионы заражают вируссодержащей аллантоисной жидкостью предыдущего цикла, имеющей отрицательную и/или положительную реакцию гемагглютинациипри минимальной инфекционной активности, при этом при использованиивируссодержащей аллантоисной жидкости с положительной реакцией гемагглю 5 1564185 6Получают целевые продукты (ВАЖ)с характеристиками, указанными втабл.4,Как видно из табл.3 наибольшаястепень обогащения ВАЖ инфекционнымвирусом имеет место при экспозиции18-24 ч. В этом режиме наблюдаетсярезкий максимум удельной активности(ИА:ГА), что свидетельствуето повй 1 Ошенин качества целевого продукта.. П р и м е р 3 Получение биомассывакциониого штамма вируса гриппаА/Техас/1/7 а/НЗ 112/ в зависимости отчисла пассажей.Маточный лиофилизированный вирусуказанного штамма пассируют на РКЭпри 35 С; экспозиция 20 чСтадиюнакопления вируса проводят, как опи"сано в примере 2, после 1,2,3 и 4 пассажей. Результаты контроля полученнойВАЖ приведены в табл.5 (отбор материала для последующего пассирования производили, как в примере 2).Из табл.5 видно, что одного пассажа недостаточно для обеспечения высокого качества целевого продукта.П р и м е р 4. Маточный лиофилизиронанный вирус гриппа штаммаА/Техас//7 а/НЗИ 2/ двухкратно пассируют при 35 С и экспозициях 7,8 и10 ч (предлагаемый режим) и 5 и 14 ч(запредельные режимы). Во 2-ом циклепассиронания РКЭ заражают ВАЖ с положительной РГА при минимальной дозе35заражения эмбрионон предыдущего цикла(1 О ЭИП /0,2 мл). После 11 пассажасобирают ВАЖ из эмбрионов, еще содержащих вирус по данным РГА в последнем разведении, Эта ВАЖ является посевным материалом для стадии накопления вируса.Стадию накопления вируса проводяткак в примере 2,ВАЖ отбирают. Получают целевойпродукт с характеристиками, приведенными н табл,б.Как видно из табл.б, только впредлагае 1 ом режиме достигается высокое качество целевого продукта попоказателю удельной активности.П р и м е р 5. Маточный лиофилизированный вирус гриппа штамма А/Техас//1/7 а/НЗИ 2/ пассируют при 35 С в течение 8 ч, Для второго пассажа отбирают ВАЖ с отрицательной РГА при дозе заражения 0,1 и 0,01 ЭИД/0,2 млВторой пассаж проводят инкубированиемв течение 20 ч. После П пассажа со,1564185 тинации цикл пассирования устанавливают в 710 ч, апри использовании вируссодержащей аллантоисной жидкосаблица 1 е тщщ, щюъмщщщщщщ щ щщщщ т 11 ЭИД,0,2 млисходного м:териала Разведение ви 1. а Показатель 1010 ф 10 ф512 256 256 32 в РГА Доза заражения 16 32 3 0,03 0,00 лн,ца 2 Доза п/02 ЭИД, зара щего азведение вирус каэ атег чения заражающего материала 1 пассажа а 10-10-ф 101 О ала 1 пас 0,31 Число змбриов которых обружеи вирусРГА о аОбр, титрв РГАДоза зараженОбнаружен вирус в РГАОбр. титрДбза зараженияОбнаруженвирус в РГАОбр. титрДбза зараже- ния 024 512 1024623 562 56 06 0,006 иЯ 5,6 0,0 3 02 0,002 0,000 8 0,2 101 0 2 0 0 0,01 0,001 0,0001 Таблица Э ведение вируса Доза полу чения заражающего материала П пассаИД /02 мп ажаю оказатели 0 1 О 1 1010 0 щего материала 11пассажа ж 4 3 Эмбрионы с обнаруженным вирусомОбр, титр в РГАДоза зараже- ния 256 64 16 16 256 32 8 тыс. 780 178 18 18 0,2 32 0,02 0,0 Число эмбрионов, в которых обнаружен вирус вРГАОбратныйтитр вируса ти с отрицательной реакцией гемаггяотинации цикл пассирования устанавливают. в 1824 ч,1564185 10Продолкение табл,3 ЭИД /О,2зара%еющего материала Ппассааа Разведение виру Пок аз а тели О1 О О 228 256 Эмбрионы собнаруяеннвирусом 2 1 6 128 16тр И 0 51 1051Оф10 7,7,1 О 14 7 Доза полу чения заражающего материала 11 пассаОбр,тиРГАДоза знияЭмбриообнаружвирусоОбр.тиРГАДоза э нияЭмбрионы собнаруженнымвирусомОбр.,тигр вРГАДоза заражеиия 64 5,2 256 7,2 256 7,6 512 7,32048 6,2 5 Не определяется1564185 12 Таблица 7 Характеристика Прототип Инфекционнаяактивно сть 1 я0,20,04 7,50,04ЭИД,/О, 2ь,ттОбр, 576+55 480+46 7,4 4,8 Состав итель С . Св етлышевТехред Л.Олийнык КоРРектоР С, Шевкун Редактор Л. Веселовская Заказ 1139 Тираж 478 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская ндб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 Гемагглютинирующая активностьИА : ГА . Единицыизмерения Предлагаемыйспособ