Способ исследования секреторных функций нейтрофилов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 4 О О 1 И 33/48 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ЕЛЬСТВ К АВТОРСКОМУ С.3 л(56) Мопр: 1,. е 1 оп оГ 1 е апй 1 цппап пеи 1 гоЯ Ме 1 Ьойэ, 11 7,а 1, Пе йепСГ 1 саС гесерСогз опя, Б. о 1 1 пдпипо 1.975, с, 69-76. ло ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ( 71 ) Челябинский государственныймедицинский институт(54) СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ СЕКРЕТОРНЬХ ФУНКЦИЙ НЕ 1 ПРОФИЛОВ(57) Изобретение относится к облати медицины, точнее к клиническойиммунологии, и предназначено дляизучения секреторных функций нейтфилов в норме и при различной патлогии. Целью изобретения являетсяповьшение точности исследования скреторных функций нейтрофилов че ЛО 1287006 А 1 века путем культивирования выделенных из периферической крови чистыхнейтрофилов в среде 199 с активирующими агентами или беэ агентов. Активацию нейтрофилов проводят путемвнесения в среду 199 взвеси частицполистирольного латекса. диаметром1,7 мкм или взвеси частиц латекса,покрытого метакриловой кислотой сдиаметром 1,0 мкм. Затем клеточнуювзвесь центрифугируют, супернатантактивированных и неактивированныхнейтрофилов используют для изучениявлияния супернатанта на активностьлейкоцитов по способности их восстанавливать нитросиний тетраэолий вдиформазан, а также на лиэосомальнуюактивность, фагоцитоэ моноцитов.Нейтрофилы выделяют различные веществав супернатант, при этом неактивированные нейтрофилы выделяют продукты,снижающие функции моноцитов, а активированные нейтрофилы, продуцируютвещества, резко усиливающие функциимоноцитов,12 Дпя вьделения моноцитов часть мо 6нонуклеаров в концентрации 10 клеток вмл инкубировалась в течение 1 ч при 37 С в пробирках "сапожках", 45 на дне которых находились покровные стекла, Затем клетки, прилипшие к стеклу, отмывались от лимфоцитов средой 199 и использовались для изучения влияния супернатантов активи рованных и неактивированных нейтрофилов на лизосомальную активность, фагоцитоэ моноцитов и способность последних восстанавливать нитросиний тетразолий (НСТ) в диформазан. Вторая часть мононуклеарных клеток, не помещенных в "сапожки", доводилась до, концентрации 1 0 клеток на 1 мл и использовалась для определения Активированных нейтрофилов Мфм 346+0,04 3 0,00 0,671+0,043. Неактивиро- М 1 мванных ней- трофилов и Изобретение относится к медицине, точнее к клинической иммунологии, и предназначено для изучения секреторных функций нейтрофилов в норме и при различной патологии.Целью изобретения является повышение точности исследования секреторных функций нейтрофилов человека.Поставленная цель достигается тем, что осуществляют культивирование вьделенных иэ периферической крови чистых нейтрофилов в среде 199 с активирующими агентами или без аген тов, центрифугируют клеточную взвесь, удаляют супернатант, с последующим использованием супернатантов активированных и неактивированных нейтрофилов как факторов, влияющих на. активность лейкоцитов.П р и и е р 1. Исследовали влияние секрета нейтроилов, выделенных " иэ крови доноров, на аутологичные моноциты, Для этого гранулоциты и мононуклеары выделялись из периферической крови людей путем центрифугирования на двойном градиенте, плотность нижнего раствора фиколл-уротраст 1,093, верхнего - 1,077. На границе между растворами образовывалось кольцо гранулоцитов, между плазмой и верхним раствором фиколлуротраста-мононуклеаров, После выделения клеточные суспенэии отмывались средой 99. Морфологический контроль мазков, окрашенных по Романовскому-Гимзе, показал, что в верхнем слое 70-757 клеток составляли лимфоциты, 10-207. - моноциты, 5-10 Х - гранулоциты, в нижнем кольце - 1003 клеток были нейтрофилами. 87006 2действия супернатантов нейтрофиловна хемотаксис моноцитов.Взвесь гранулоцитов из нижнегокольца раэводилась 6 средой 199 доконцентрации 5 1 О клеток в 1 мл иразливалась поровну в две пробиркиВ 1-ю пробирку вносилась взвесь ча 8стиц латекса (из расчета 10 частиц6на каждые 5 10 нейтрофилов), во 10 вторую - такой же объем среды 199,Пробирки с гранулоцитами инкубироовали в течение 1 ч при 37 С. Активацию нейтрофилов определяли по изменению числа лизосом. В 1-й пробир ке ( активированные нейтрофилы) лизосомальная активность 646,74+28,76(п=20), во второй (неактивированныенейтрофилы) - 459,1+19,8 (п=20).Содержимое пробирок центрифугирова ли при 1500 об/мин в течение 5 мин,Супернатант использовался как хемоатрактант, а также добавлялся в "сапожки" в количестве 1 мл для оценкиего влияния на фагоцитарную, лизо сомальную активность моноцитов, атакже на реакцию восстановления этими клетками НСТ в диформазан.Фагоцитарная (по захвату частицлатекса) и лизосомальная (по числу лизосом) активность оцениваласьпо методу И.С.Фрейдлин, реакция восстановления НСТ - по количеству активных клеток, содержащих гранулы,и по индексу восстановления НСТ вдиформаэан, хемотаксическая активность моноцитов исследовалась подагарозой по методу Р.Д,Нельсона исоавторов, Результаты представленыв табл. 1-3.40 Влияние супернатанта активированных (АН) и неактивированных (НН)нейтрофилов на хемотаксис сингенныхмоноцитов представлено в табл, 1,Таблица 13 1287006 4Продолжение табл.1 П р и м е ч а н и е: р - досто 5верность различий по отношению кконтролю,(0,00 Влияние супернатантов АН и НН на0,99 фО,О 5 фагоцитарную и лизосомальную активность сингенных моноцитов представ 20 лено в табл, 2,Контроль фм(взвесь латекса л Таблица 2 Вид супернатанта Статист. Интенсивность Содержаниепоказатель фагоцитоза лизосом Активированныхнейтрофилов 329) 3+24,64 104,5+8,65 1.+м 10 О, с 0,05 с 0,05153,4+5,46 Контроль (среда 1+м199) 253, 85 ф 19, 24 10 10 П р и м е ч а н и е: р - достоверность различий по отношению к контролю.Фагоцитоз определяли в отношении моноциты:латекс 1:20. Таблица 3 ые 40,27+5,6 Активированнынейтрофилы 0,873 0,13 сО,09+4,3 429+0,08 1 Влияние супернатанта АН и НН на реакцию восстановления сингенны ми моноцитами нитросинего тетразолияв диформазан представлено в табл,3.1287006 Продолжение табл.3 0,2890,035 20, 75 ф 2,05 Контроль 10 12 П р и м е ч а н и е; р - достоверность различий ло отношению к контролю. Продолжение табл.4 0,645+0,043 Неактивированные ней трофилы 12 О, 001,99 ф 0,01 онтроль Мвзвесь чатиц латекса) п ние: рению к кон и остоолю,НН на 1,542+0,1 Активированые нейтрофилы атантов АНзосомальнумоноцитов 3 и О, 001 аблиц ид супернатанта Статист. Интенсивность Содержан показатель фагоцитоза лизосом,5 ф 20 11,75+13 тивированныейтрофилы 0,00 Неактивированнынейтрофилы М+ 02, 63 118, 01 263, 5+ 21, 37 0,05 65,8318,04 253,82+19,212 1 О Мфм онтроль (с99) П р и м е ч а н и е: р - достоверность различийношению к контролю,фагоцитоз определяли в отношении моноциты:латек о от:10 П р и м е р 2. Изучалось влияние нейтрофилов на алогенные моноциты доноров. Исследование проводилось по методике, описанной в примере 1. Результаты представлены в табл, 4-6,Влияние супернатанта АН и НН на хемотаксис аллогенных моноцитов представлено в табл. 4.Таблица 4 верность по отноВлияние супер фагоцитарную и л ность аллогенных ленп в табл. 5.1287006 Индекс восстановления нитросинего тетразо- лия Активныемоноциты,% показатель Активированныенейтрофилы с 0,05(среда 199) 10 12 Таким образом, из полученных нами данных видно, что нейтрофилы вы деляют различные вещества в супернастант, при этом неактивированные нейтрофилы выделяют продукты, снижающие функции моноцитов, а активированные нейтрофилы продуцируют вещест Вя, резко усиливающие Функции моноцитов, У рожениц с послеродовой инфекцией отмечается резкое снижениеспособности нейтрофилов к синтезуактивирующих моноциты веществ, 40 Как видно иэ представленных примеров, предлагаемый способ исследования секреторных функций нейтрофилов позволяет изучить влияние секретов активированных и неактивированных нейтрофилов на функциональнуюактивность мононуклеаров человекакак в аутологичном, так и в аллогенном сочетании, что позволяет расширить представление о Функциях нейтрофилов, в частности о влиянии продуктов их секреции на активностьдругих клеток, а главное дает новыйподход к оценке ранее неизученныхсекреторных Функций нейтрофилов человека в клинической практике.Формула изобретения 312,3+18,144 Активирован ф+м ных нейтрофилов и 100с 0,01 193,6+6,02 1" фм Неактивированных нейтрофилов,1 О П р и м е ч а н и е: р - достоверность по отношению к контролю. Влияние супернатантов АН и НН нареакцию восстановления нитросинегоВид супернатантов Статист. Неактивированные 1 ффмнейтрофилы П р и м е р 3. Изучали влияние супернатантов активированных и неактивированных нейтрофилов рожениц с присоединившейся послеродовой инфекциейИсследование проводилось .по той же системе, что и в примерах1, 2.Данные влияния супернатантов АН и НН рожениц с послеродовой инфекцией на активность моноцитов доноров представлены в табл. 7.Таблица 7 Супернатант Статист. Содержаниепоказа- лиэосомтели Р с 0, 001Контроль И+м 410,0+5,77/Таблица 6 39,71+ 9,22 0,727+0,165 29,66+6)94 0)5080,065 Способ исследованиясекреторныхфункций нейтрофилов, включающий вы 9 1287006 10деление чистой популяции нейтрофилов вацию путем внесения в среду 199 из крови, культивирование нейтрофа- взвеси частиц полистирольного латекгов на питательной среде и исследова- са диаметром 1,7 мкм или взвеси часние свойств нейтрофилов иммунологи- тиц латекса, покрытого метакриловой ческими методами, о т л и ч а ю -- 5 кислотой с диаметром 1,0 мкм, далее щ и й с я тем, что, с целью повьпие- проводят выделение супернатанта акния точности способа, в качестве пи- тивированных нейтрофилов и изучение тательной среды используют среду влияния супернатанта на лейкоциты 199, а при культивировании нейтрофи- проводятпо способностиих восстанавли - лов дополнительно проводят их акти вать интросинийтетразолий в диформазан,Составитель А.МакаровРедактор Н, Слободяник Техред Л.Олейник Корректор М,ДемчикЗаказ 7708/45 Тираж 776 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по. делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раущская наб д. 4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4