Способ получения гибридных клеток

(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИ КЛЕТОК, включающий слиян элиминацию родительских ледующее выращивание. и к гибридных клеток, о т л щ и й с я тем, что, с цспособа и сокращени инацню родительских дят последовательным ис интерферонов и .цитоцидн 8 нияэлнм ГОСЗЩМРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССОР ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ(56) 1.ХЬа К.Кнепер. 1976, ч21,1 СС 1 ейч. 145, р. 709 Бюл. Р 5влянский, А.М.Амченкова, а и Я.Е.Хесинрудового Красного Знамеедовательский институт и микробиологии импоН.Ф.Гамалеи5.45(088.8)ей а 1 Яошайас се 112, р. 215-233. е 1 й У.Ю. Зс 1 епсе. 1964, -710 (прототип). Я ГИБРИДНЫХие клеток,клеток, послонированиеи ч а юелью упрощево времени,клеток провоольэованиеми вирусов,11384Изобретение относится к медицине, биологии, сельскому хозяйству, иммунологии, в частности к генетике соматических клеток.Метод гибридизации соматических клеток в последние годы приобрел исключительно важное значение при решении практических и теоретических задач биологии, медицины и сельского хозяйстваОн используется для карр тирования.локапизации генов в хромосомах, для анализа. регуляции генов в клетках эукариотов, изучения механизмов контроля роста и дифференцировки клеток в процессах развития зародышей, заживлении ран, образовании опухолей. Применение этого метода в медицинской практике расширяетвозможности генетического консульти. рования, выявления латентных опухолеродных вирусов, проверки опухолевых клеток на присутствие в них онкогенных вирусов. Наконец, гибридизация клеток лежит в основе получения гиб- . ридом продуцирующнх моноклональные 25 актитела, которые находят разнообразное применение в иммунологии и биох юани.Известен способ получения гибридных клеток, в котором используется селективная система, характеризующая-ся теь., что в,ней маркируется одна родительская клетка представляющая собой двойной мутант, устойчивый как к тиогуанину, так и к уабаину (Уаф), При слиянии такой мутантной35 клетки с нормальной клеткой, чувствительной к уабаину (ГГФРТ+, Уа ),Ч образуются гибриды, способные расти в селективной среде, содержащей40 гипоксантин, аминоптерин и тимидин, так называемой средеГАТ, в которую также добавлен уабаинРодительские клетки в этих условиях элимини,руются 1,1.Наиболее близким к изобретениюпо технической сущности и достигаемому результату является способ получения гибридных клеток с помощью выращивания мутантных клеток, устой чивых к азагуанину (АГ") (в клетках отсутствует фермент ГГФРТ) и бромдезоксиуридину (БУдР) (в клетках отсутствует фермент тимидинкиназа " ТК), их слияния с применением поли этиленгликоля (ПЭГ) кпи вируса Сендай и выращивания на селективной среде ГАТ, где родительские мутант 12 3ные клетки погибают, а гибридные выживают 21.Недостатками известных способов являются необходимость получения н выращивания мутантных клеток, длительность процесса получения иизучения мутантных клеток, необходимость использования дорогостоящих биологически активных веществ.Цель изобретения - упрощение способа и сокращение во времени.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения гибридных клеток, включающему слияние клеток, элиминацию родительских клеток, последующее выращивание и клонирование гибридных клеток, элиминацию родительских клеток проводят последовательным использованием интерферонов и цнтоцидных вирусов.Способ осуществляют следующим образом.Родительские клетки скрещивают, выращивают на питательной среде до монослоя, состоящего из смеси родительских и гибридных клеток, удаляют из культуральных флаконов клетки сначала одного родителя, а затем другого и культивируют оставшиеся клетки до .образования колоний. Для скрещивания используют интерферончувствительные клетки родительских линий. Удаление родительских клеток производят путем последовательной обработки сначала интерфероном, специфическим дпя одного вида родительских клеток, и заражения цитоцидным вирусом, элиминйруя таким образом родительские клеткидругого вида, и далее, после отмывания культуры, внесением в нее интерферона, специфического для второго вида клеток, заражением цитоциднымвирусом, который элиминирует родительские клетки первого вида, врезультате чего сохраняются лишь гибридные клетки. П р и м е р . Выделение гибридных клеток при скрещивании в суспензии перевиваемых клеток мьпии 1.з и перевиваемых человеческих клеток 3Для слияния используют культуру человеческих клеток 1-96, чувствительную к человеческому лейкоцитарному интерферону, и линию мышиных клеток 1 , чувствительную к действию мышйного интерферона. Слияние проводят с помощью 503-ного раст3 11384 вора ПЭГ. Снятые трипсином и отмытые клетки Хв количестве .6 10 и з в количестве 9 10й 4 перемешивают, центрифугируют 1 О мин при 2501, надосадок отсасывают и на клетки наслаивают 1 мл раствора ПЭГ, перемешивают легким потряхиванием 80 с, дважды промывают средой .199 с последующим центрифугированием и высевают во флаконы нли чашки Пет ри из расчета 3 10 клеток/мп с 203 змбриональной сыворотки крупного рогатого скота (КРС), через 2 ч меняют среду на свежую того же состава.Полученная в результате слияния смесь клеток состоит из родительских клеток обоих видов и двух групп многоядерных клеток: гомокарионов, содержащих ядра одного типа клеток, и гетерокарионов (ипи гибридных клеток), содержащих ядра обоих родительских типов. Для избирательного выделении и размножения гибридных клеток необходимо добиться гибели всех названных типов клеток, кроме гетеро карионов. Через 18 ч среду заменяют на среду 199 с 23 эмбриональной сыворотки КРС с добавлением мышиного интерферона из расчета 50 ед/мп.Через 6 ч вводят вирус везикулярного12 4,стоматита (ВВС) из расчета 2 10 ТПД /мп. Через 18 ч, т.е. после гибели человеческих клеток и гомокарионов, не несущих рецепторов к мышиному интерферону, клетки отмывают от вируса раствором Хенкса (или освобождаются от вируса введением антисыворотки). Заливают среду 199 с 203 эмбриональной сыворотки КРС с добавлением.человеческого лейкоцитарного интерферона из расчета 80 ИВ/мл.После 6 ч вводят вирус ВВС из расчета 2 10 ТЦД /мп. Через 18 ч клетки отмывают от вируса раствором Хенкса (или освобождаются от вируса введением антисыворотки) и заливают средой 199 с 203 эмбриональной сыворотки КРС с добавлением глютамина.Колонии гибридных клеток, появляются через .2 недели, их реклонируют и размножают.Предлагаемый способ позволяет иолу" чить гибриды соматических клеток.,Иетод применим как дпя получения межвидовых гибридных клеток, когда родительские культуры чувствительны к интерферону, так и дпя получе" ния внутривидовых гибридов в случае, .если один из родительских парт. неров не чувствителен к .интерферону.1Составитель В.Кузьмичев Редактор И.Дербак Техред И;Надь. Корректор О.Билак евав ю Заказ 10634/18 Тираж 525 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по Делам изобретений и открытий 113035, Иосква, Ж, Раушская наб. д. 4/55Филиал ППП"Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4