Способ индикации микроколичеств липидов

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик 111991304(22) Заявлено 1607,81 (21) 3316579/28-13с присоединением заявки Йо(23) Приоритет 11)М Кп 3 С 01 И 33/52 Государственный комитет СССР по делам изобретений и открытийДата опубликования описания 239183(54) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ЛИПИДОВ Изобретение относится к биохимии,1 а именно к способам индикации микро- количеств липидов на хроматограммах в тонком слое силикагеля.Известен способ индикации микро- количеств липидов на хроматограммах в тонком слое силикагеля, включающий обработку хроматограмм в камере с парами иода до проявления окрашенных пятен липидов. Время анализа составляет 40-50 мин,чувствительность способа - до 1 мкг ненасыщенных липидов (1 ) .Однако этот способ является дли-. тельным и позволяет определять липиды только с ненасыщенными связями,Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ индикации микроколичеств липидов на хроматограммах в тонком слое силикагеля, представляющий обработку хроматограмм раствором флуорохрома с последующим обнаружением на них пятен липидов в ультрафиолетовом свете. Готовые хроматограммы обрабатывают раствором родамина В. Способ позво- . ляет обнаруживать фосфолипиды и воска Г 2Однако известный способ не позволяет обнаруживать все классы липидов(триглицериды, эфиры жирных кислот)одновременно, а также достаточно длителен (40-50 минут) и обладает низкой чувствительностью (5-10 мкг).Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорениеспособа.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу индикациимикроколичеств липидов на хроматограммах в тонком слое силикагеля путем обработки хроматограмм растворомфлуорохрома с последующим обнаружением на них пятен липидов в ультраФиолетовом свете, в качестве Флуорохрома используют раствор 2,7,10-производных ксантена - пиронина 6 илиродамина С или родамина 6 Х в количес О тве 0,005-0,025, а перед облучением ультрафиолетовым светом хроматограммы обрабатывают парами иода в течение 3-5 мин.До нанесения на пластины силикагель суспендируют в 0,005-0,025-ном+ + - + + Свободные жир- ные кислоты (пальмитиновая кислота) + при условии: а) К -Б(СИз)2К 2 " (СИЗ)гК -Нпйронин 6б) К 4 (СИ 3)2К 2 - ф Х(СИз)2и,-ДСООИродамин Св) К-МНС 2 Ня,-( )СООС ,родамин 6 ЖПри облучении ультрафиолетовым светом липиды обнаруживают н виде темных пятен на общем светящемся фоне. Эффект имеет кесто за счет липотропности иода и его способности в ионной форме гасить флуоресценцию.П р и м е р 1. Готовят суспензию 2,5 г силикагеля н б мл 0,005- ного (вес) водного раствора пиродина С и наносят ее на пластину 9 х 12 см После высушивания пластины активируют при 115 С 30 мин, На стартовую линию наносят исследуемый раствор - экстракт по Фолчу из биопрепарата . "Протеин" - н количестве 0,001 мл с содержанием липидон в пробе 50 мкг. В качестве контроля берут экстракт по Фолчу из сыворотки крови, распределение липидов которого в данной системе растворителей известно ы проверено по стандартным растворам кефалина, холестерина, 5 пальмитиноной кислоты, триолеинаи эстерифицированного холестерина.Липиды фолчевских экстрактов поднергали хроматографии в системе петролейный эфир:диэтиловый эфир:ледяная 16 уксусная кислота (9010:1). Послеразделения липидов пластины помещают на 3-5 мин в камеру с парами иода и затем обнаруживают пятна липидов при облучении ультрафиолетовым снетом ( А = 180-320 нм).П р и м е р 2. Аналогично примеру 1 готовят пластины для хроматографии, на стартовую линию наносят в виде точечных пятен по 1 мкл хлороформного раствора липида (кефалин, свободный холестерин, пальмитиноная кислота, триолеин, эстерифициронанный холестерин). На одну пластину наносят один класс липидов и виде растворов с заданным содержанием вещества н 1 мкл, для этого готовят серий разведений - 10 , 10 6, 10 , 10 э г/мкл. После проведения хроматографии и проявления пятен в парах иода, как описано н примере 1, пятна липидон обнаруживают в ультрафиолетовом свете.Аналогично готовят взвесь силикагеля в 0,005-ном (вес) растворе (водном) родамина С или родамина 6 Ж 35 и наносят ее на пластины для хроматографии, После приготовления пластин проводят хроматографию и проявление липидон.Чувствительность предлагаемого спо соба к различным классам липидов нсравнении с известным определением в парах иода представлена н табл. 1.+ + .+ + + + + П р и м е ч а н и е. Здесь и далее в таблицах в каждом определении не менее 4 опытов. Как видно иэ табл. 1, чувствительность предлагаемого способа на порядок выше по отношению ко всем классам липидов, т.е. составляет 10 " вместо 10-ь г для всех классов, кроме пальмитиновой кислоты, для которой чувствительность составляет 10" вместо 10-8 г.П р и м е р 3. Готовят суспенэию 2,5 г силикагеля в 6 мл водного раствора пиронина 6, родамина С и родамина 6 Ж различных концентраций и проводят обработку пластин, хрома 20тографию и проявление липидов попримеру 1. Липиды на пластины наносят в соответствии с определяеьвмминимумом 10г для всех классовлипидов, кроме свободных жирных кислот, для которых определяемый минимум 10 г.Результаты определения установления оптимальной концентрации и еепределов для водных растворов флуо 3 ф рохромов при определении липидовпредлагаемым способом приведены втабл. 2,+ + 1 о Э 2х о х о о 1 б о ц о ЦЭО ЭНЮ йд Ц сдм 1 3 дО доц до айх с"1 1 1 сП1 й1 О1 д1о1 Ю1 й111 311 б1 йх1 Э1 Ц1 Х1 О1 Х11111111 о10 991304 10 Кефалин Холестерин свободный Пальмитиновая кислота Триолеин+ + + - + + + + + + + + Эстерифинированныйхолестерин формула изобретения ВНИИПИ Заказ 122/61 :Тираж 871 Подписноефилиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 Как видно иэ табл, 2, оптимальная концентрация Флуорохромов для определения всех классов липидов 0,005, Снижение концентрации до 0,001 не дает четкой картины при определении всех классов липидов, увеличение свыше 0,025 не влияет на результат определения, но сильное свечение Фона приводит к быстрому утомлению зрения, Поэтому рабочие концентрации растворов лежат в пределах 0,025- 0,005. Оптимальная концентрация в этих пределах практически не выявляется.П р и м е р 4. Определение оптимального времени проявления пятен Как видно из табл. 3, оптимальное время проявления пятен липидов составляет 3-5,мин. Сокращение этого времени не дает описанного эффекта, а.увеличение его приводит к гашениюфлуоресценции не только в местах локализации липидов, но и по всей пластине.Предлагаемый способ по сравнениюс известным позволяет сократить время анализа до 20-25 мин, повысить чувствительность определения на 1-2 порядка, а также определять кярокий круг липидов независимо от их класса и иредельности. Способ индикации микроколичествлипидов на хроматограммах в тонкомслое силикагеля путем обработки липидов на хроматограммах, флуорохромированных 0,005-ным водным раствором пиронина С.Аналогично примеру 1 готовят 5 пластин, Флуорохромированных 0,005- ным водным раствором пиронина С, родамина С или родамина 6 Ж. На стартовую линию всех пластин наносят в виде точечных пятен хлороформные растворы липидов в концентрации 10 5 г/мкл в количестве 1 мкл. Хроматографию всех пластин проводят обычным способом, а затем помещают их в камеру с парами иода. Время проявления пятен липидов для каждой пластины указано в табл. 3.Таблица 3 хроматограмм раствором флуорохромас последующим обнаружением на нихпятен липидов в ультрафиолетовом све 45 те, отличающийся тем,.ч-о, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, в качестве Флуорохрома используют раствор2,7,10-производных ксантена - пиро 50нина С.или родамина С,или родамина6 Ж в количестве 0,005-6,025,а передоблучением ультрафиолетовым светом хроматограммы обрабатываютпарами иода в течение 3-5 мин.55Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. ВосЬ Е. А.,СгоээЬегд Я. Е,