Способ количественного определения группового состава липидов

(54) (57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО РЕДЕЛЕНИЯ ГРУППОВОГО .СОСТАВА Ли включающий разделение смеси мет тонкослойной хроматогра 4 ии на в ленном слое силикагеля, импреги ванном обугливаав 1 нм агентом, .на ние с последующим денситометри. вием, о т л и ч а ю щ и й с ячто, с целью повыаения точности лиза, в качестве обугливающего та используют сульфат гидроксил на, взятый.в количестве 10-15 реса снликагеля, и нагревание рри 200-210 фСв течение 20-30 ОППИДОВ 13н, О. Д. Дороний и А;П. Нечаев акреп- ниро- грева- роватем,анаагенена Трудовог хиологнчески омналенности ) 1. ф,1 оц гп а 128, Е 1,ведут н.(71) Московский орд Красного Знамени те институт пищевой пр (53) 543.54, 42(089.8 (56) 1. НолаеМ 1 дего оГ СЬголайодгарйу".133-139(прототип),; а Ф Е О О Ю Э г 1 Е; ЖОми". Л1 Р Б Л д " Т г" 11010554 Изобретение относится к способу количественного определения группового состава липидов.Известен.спооб количественного определения нейтральных липидов после хроматографического разделения смесей липидов в тонком слое силикагеля импрегнированного обугливающим агентом - сульфатом аммония в количестве 10 от веса аммония.Для обнаружения эон локализации 10 липидов пластины с тонким слоем нагревают при. 187 ОС в течение 10 мин, при этом органические вещества обугливаются. Количественное измерение обнаруженных зон проводят путем ден ситометрирования (1).Однако известный способ имеет недостаточную. точность количественного определения группового состава липидов, содержащих остатки насыщенных жирных кислот, вследствие малой степени обугливания их в сравнении с селективным обугливанием липидов, включающих остатки ненасыщенных жирнйх кислот. 25Цель изобретения - повышение точности количественного группового со" става липидов.Поставленная цель достигается согласно способу количественного определения группового состава липидов, включающему разделение смеси методом тонкослойной хроматографии на закрепленном слое силикагеля, импрегнированном обугливающим агентом - сульфатом гидрбксиламина, взятым в количестве 10-15 от веса силикагеля при нагревании пластин при 200-210 фС в течение 20-30 мин и последующим денситометрированием. 50 40Способ осуществляется следующимобразом. Искусственные или природные смеси липидов подвергают хроматографическому разделению: на стеклянныхпластинах размером.25 х 75 мм с закрепленным слоем силикагеля, содержащимсульфат гидроксиламина. Для приготовления пластин суспензию из1,050 г силикагеля, 0,105 г гипсаи сульфата гидроксиламина в 7,5 мл дистиллированной воды разливают на10 пластин по 0,75 мп, сушат при комнатной температуре и затем активируют при 110 С в течение часа. Пластины хранят в эксикаторе над хлоридом кальция. Перед нанесением образца пластины чистят в системе растворителей гексан : диэтиловый эфир г уксусная кислота (50:10:1). Для про ведения хроматографического разделения на пластину наносят 1 мкл 23 раствора, смеси липидов в хлороформе :и проводят хроматографическое разделение восходящим методом в стеклян ной камере объемом 0,5 л в вышеуказанной системе растворителей. Обнару.жение липидных зон осуществляют прогреванием пластин в термостате и последующим денситометрироэанием, Обсчет денситограмм проводят по методувнутренней нормализации. Экспериментальные данные обрабатывают по методике Евтоподента с надежностью 0,95.Число повторностей в каждом опытене менее пяти,Данные количественного анализа.искусственной смеси жирных кислоти ряда ацилглицеринов убедительноиллюстрирует преимущества использования в качестве обугливающего агента сульфата гидроксиламина передсульфатом аммония (табл 1, обнаружение липидных зон проводили прогреванием пластин при 210 С в течение30 мин).Ошибка определения насыщенныхи ненасыщенных компонентов () составляет 2,2-3,2, в то время какпри использовании в качестве обугливающего агента сульфата аммойияпо известному способу она достигает41,5-62,2.Использование предлагаемого способа обеспечивает значительное снижение различия в интенсивности обуг,ливания насыщенных и ненасыщенныхсоединений и повышение точности определения липидов, содержащих остатки насыщенных жирных кислот (табл.2,площадь пика линоленовой кислотыпринята за 100)Подобный сравнительный анализпромышленных липидных смесей (подсолнечное масло и пальмовый стеарин)показали, что если при количественном определении липидов, содержащихвысокийненасыщенных жирных кислот(подсолнечное масло), не наблюдает;ся существенных различий по предлагаемому и известному способам, тов случае высоконасыщенного масла использование сульфата аммония в качестве обугливающего агента непригодно иэ-эа значительных расхождений(т.абл, 3),В табл, 3 приведены результатыопределения содержания триглицеридовденситометрическим методом. Сравнительный анализ количественного состава природных липидов (дрожжевые микроорганизмы) по предлагаемому способу, весовым методом и с применением сульфата аммония в качестве обугливающего агента (табл. 9 4) показывает, что предлагаемый способ обеспечивает большее совпадение с весовым способом, нежели известный.В табл, 4 приведены результаты количественного определения группового состава липидов дрожжей,в 7-18 раз. 65 Приведенные выше данные показывают, что предлагаемый способ обеспечивает значительное увеличениеточности количественного анализа(от 5,9 до 41,5) липидов, содержащих остатки насыщенных жирных кислот(три-, ди- и моно- ацилглицерины,фосфатидилхолин) вследствие того,что он позволяет избежать селективного обугливания липидов с ненасыщенными жирными кислотами.П р и м е р 1. Пластины, приготовленные как указано выше, прогревают при 190, 200; 210 и 220 С. Интенсивность пятна маргариновой кислоты (С .а ), определенная на денситометре относительно интенсивностипятна линоленовой кислоты С з), приведена .в .табл. 5 (отношение площадейСл.Опиков19 ЪП р и м е р 2Приготовлениепластинок с закрепленным слоем силикагеля, импрегнированного 10 сульфата гидроксиламина.Для приготовления 10 пластинокк силикагелю (1,050 г) и гипсу(0,105 г) приливают раствор 0,105 гсульфата гидроксиламина в 7,5 млдистиллированной водой и тщательнопЕремешивают. На одну пластинку наносят 0,75 мл суспензии. Пластинкисушат при комнатной температуре изатем активируют при 110 аС в течение часа. На пластинку наносят 1 мкл.2-го раствора кислоты (0,02 мг) вхлороформе и хроматографировании,как описано выше. Обнаружение кислотосуществляют, прогревая пластинкив термостате при 210 чС в течение30 мин с последующим денситометрированием,П р и м е р 3. Приготовлениепластинок с закрепленным слоем силикагеля, импрегнированного 5 сульфата гидроксиламина,Для приготовления 10 пластинок(0,105 г) приливают раствор 0,0525 гсульфата гидроксиламина в 7,5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают, На одну пластинку наносят0,75 мл суснензии. Подготовку пластинок, нанесение образцов, проявление хроматограмм и обнаружение проводят как указано в примере 2.П р и м е р 4, Приготовлениепластинок с закрепленным слоем силикагеля, импрегнированного 20 сульфата гидроксиламина. Для приготовления 10 пластинок к силикагелю(1,050 г) и гипсу (0,105 г) приливали раствор 0,21 г сульфата гидроксиламина в 7,5 мл дистиллированнойводы и тщательно перемешивают, Наодну пластинку наносили 0,75 мл суспензии. Подготовку пластинок, нанеение образцов,-проявление хроматограмм и обнаружение проводят, какуказано в примере 2. Результаты, полученные по примерам 2-4, приведены в табл. б.Иэ данных, представленных в табл. Б, следует, что наиболее оптимальная концентрация импрегнирующего агента 10-15. При более ниэкомсодержании сульфата гидроксиламина 10 (например, 5) увеличивается различие в интенсивности обугливания насыще ной С,. и ненасыщенной СЗкислот, При увеличении концентрацииимпрегнирующего агента (например, 20) 35 интенсивность обугливания кислот неизменяется, но в связи с потемнением фона пластинки экстинкция зонуменьшается, что неблагоприятно сказывается на точности анализа.20 П р и м е р 5, Пластины, приго-Ртовленные, как указано вьаае, прогре.вались при 210 ОС в течение 10-40 мии.Интенсивности пятна маргариновойкислоты относительно интенсивности 25 пятна линоленовой кислоты приведенывтабл, 7.Как следует из данных, предстагленных в табл. 7, наиболее оптимальным является время прогрева, равное20-30 мин. При уменьшении временипрогрева (например., 10 мнн) значительно возрастает разница площадейпиков насыщенной и ненасыщенной кислот, При увеличении времени прогрева (например, 40 мин) происходит,по-видимому, деструкция линоленовойкислоты, что приводит к снижейиюточности анализа.Данные по влиянию соотношениянасыщенных и ненасыщенных соединений 40 в группе на определение данной группы липидов на хроматограммах. Сравнительные данные, полученные по предлагаемому способу и способу-прототипу, приведены,в табл. 8 1 приведены 45 средние значения не менее пяти параллельных измерений).Во всех случаях площадь пика ненасыщенного соединения принималасьза 100, влияние доли насыщенных.соединений на обнаружение опредфля"ли как разность между показаниями(выраженными в процентах) ненасыщенного соединения и соответствующейсмеси (Ь и Ьа ), Отношение этих величин ( д /ь) показывает, чтоошибка при определении на хроматограммах смесей, содержащих более20 насыщенных соединений по предлагаемому способу в 1,2-9,2 раза меньше, чем по известному, при увеличе нии содержания ненасыщенных соединений в смеси эта величина возрастает и точность определения по предлагаемому способу превыаает точностьопределения по известному способуНайдено Относитель- ( от ная ошибка, суммы) ,38,7 3,2 64,9 62,2 40,0 Триолеин МаргариноваякислотаДипальмитин 23,6 22,1 20,0 20,0 18,0 10,5 12,9 11,6 35,5 42,0 Моностеарин 20,0 15,6 22,0 10,6 47,0 2. насыщенныхкомпонентов 60,0 61,3 2,2 35,1 41,5 Х ненасыщенныхкомпонентов 40,0 38,7 3,2 64,9 62 2 фА - силикагель содержал 15 сульфата гидроксиламина,3 ФВ - силикагель содержал 15 сульфата аммония. Таблица 2. Известный способ Предлагаемый способ Анализируемыелипиды Относитель- Площадь Относительная площадь пика, ная площадь ,пиков,мм пиков, . Площадь пика,. Относитель мм ная погреш ность,3 Э с о р Э о Ц М фФ Ъ Ъ (с ОО в о в ь (Ч Ю ъ фъ см ъ сО ОО ОО ф о Ф сч 0110 1010554 Таблица Рруппы липидов Весовой метод,Обугливающий агент 95,0 118,6 Сульфат гидроксиламинаСульфат аммония 91,7 85,6 Таблица 6 Площадь пикамаргариновойкислоты С .,1:о) Относительная площадь .пиковС э;о 4 Я:Ъ Площадь пикалиноленовойкислоты С 85,8 83,1 10 95,0 15 20 94,7 Таблица 7 Отношение площадейпиков Сд: оР1 а:э Площадь пика Время прогрева,минлиноленовойкилоыС 9 ., мм маргариновойкислотыС 4 э;о ф мм 83,4 319,3 421,9 10 20 93,6 95 , 0 4 37 , 6 30 109,8 422,9 385,1 40 ПолярныеДи глицеридыЖирные кислотыТриглицеридыЭфиры стеаринов Количествоимпрегнирующего агента,Ъ от массысиликагеля 29,01,6 11,9+1,6 12,0+1,5 12 5+1,5 34,2+1,5 398,7 449,3 460,8 437,2 382,9450,7460,8 Известный способ Предлагаемый способ,Известный способ Предлагаемый способ ю ю атев ю ею 0 (диопеин) 0 0,6 99,4 10 3,7 20 9,2 0,4 99,6 98,2 22,4 12,4 40 98,02,0 67,1 32,9 60 16,4 63,436,6 2,0 98,0 80 18,3 97,8 17,5 61,5 38,5 100 (дипальмитин) 2,2. 100,0 0 0 (триолеин) 0 100,0 99,6 0,4 0,4 99,6 10 1,2 1,9 2,2 98,1 97,8 20 40 96,7 3,3 60 19,9 80,1 34,0 96 0 4,0 60 8,5 66,0 60,5 39,5 95,1 4,9 80 41,1 59,9 5,4 100 (трипальмитин) Смесь этиллинолеат:этилпальмитат 100,0 0 О (этиллинолеат) 0 100,0 0 10 1,3 0,3 20 40 1,7 5,4 98,3 9,2 9,3 2,4 97;6 22,4 60 80 96,4 3,6, 91 32,8 67,2 8,8 95,8 100 (этилпальмнтат) 37,0 63,0 Составитель В. ГбрленкоРедактор В. Пилипенко Техред А,Вабинец Корректор М. Марсши Заказ 2480/34 Тираж 871ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Рауюская наб., д, 4/5 Подписное филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Смесь диолеин:диапальмитин 100,0 О