Субстрат для закрепления бактерий и способ получения неспорообразующих бактерий рода рsеudомоnаs

(п)981358 Союз Советски иСоциалистическииРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(23) Приоритет Опубликовано 15.12.82. Бюллетень46 да делам изабретеиий и атирытийДата опубликования описания 17 . 12 .821 В.П. Тульчинская, Г А, Кожанова, Т.Щ. Беляева,Т.В. Васильева и Л.А, КалмазанОдесский ордена Трудового Красного Знаменигосударственный университет им, И,И. Мечникова(54) СУБСТРАТ ДЛЯ ЗАКРЕПЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИИ РОДА Р 5 ЕИООМОИА 5 1Изобретение относится к микро 6 иологии и методам хранения микроорганиз.мов, предназначенных для очистки загрязненных вод,Известен субстрат для закрепленияспор актиномицетов, содержащий песокв смеси с почвой1 .Недостатком указанного субстратаявляется то, что он предназначен дляхранения спор и не пригоден для ад 1 Осорбции клеток неспорообразующих бактерий, например, рода Рецдопопаз безпредварительной лиошилизации.Известен субстрат для закрепленияспоровых 6 актерий ТН 1 оЬасРРиз Гегго 11 сРацз, содержащий песок в смеси спиритом 2 ,Однако этот субстрат также не пригоден для хранения неспорообразующихбактерий. гоИзвестен также способ полученияи хранения неспорообразующих бактерий, предусматривающий адсорбциюмикроорганизмов в дисперсном субстра 2те, согласно которому лио 6 илизированные клетки бактерий адсорбируют на гранулах пемзы Е 3 .К недостаткам данного способа сле" дует отнести необходимость использования специальной. дорогостоящей аппаратуры для диойилизации культур бакте" рий. Для некоторых культур хранение в диопилизированном состоянии на гра" нулах пемзы не превышает 6 мес, что недостаточноЦель изобретения - упрощение способа и удлинение сроков сохранения биохимической активности неспорообразующих бактерий рода Рзеидогопав.Поставленная цель достигается тем, что субстрат для закрепления бактерий, содержащий песок, дополнительно содержит рыбную муку при соотношении компонентов, вес,/:Рыбная мука 80-85Песок 15-20 а такие тем, цто согласно способу получения неспорообразующих бактерий3 98135рода Рэеодощопаэ предусматривающемуадсорбцию микроорганизмов в дисперсном субстрате, адсорбцию осуществляютв процессе культивирования бактерийс субстратом, в качестве которого используют смесь рыбной муки с песком,взятых в соотношении 4:1 - 5,7:1, внесенного в среду в количестве 104 споследующим отделением адсорбированнойбиомассы промыванием ее стерильным 1 вфизиологическим раствором И помещением в стерильный 0,8-1,03-ный растворхлористого натрия при соотношении биомассы и раствора 1:8-1:10.П р и м е р 1, Осуществляют закрепление на субстрате и получение ихранение штамма бактерий деструкторовРэ. аегцц(поза КИ, способных разрушать органические красители и предназначенные для очистки сточных водвысокой цветности.В качестве субстрата для закрепления бактерий применяют рыбную муку,промытую в течение суток проточнойводой и прокаленную при 200 С в те- учение 4-х часов. Обработанная такимобразом мука представляет собой порошок коричневого цвета. Для предупреждения комкования муку смешивают спеском, который подвергают аналогичной предварительной обработке. Песоки рыбную муку смешивают при следующем объемном соотношении компонен"тов, : мука 80; песок 20, Для одного опыта берут 40 смз муки и 10 см35песка,Суточную агаровую культуру бактерий в дозе 500 млн клеток/мл вносятв минеральную среду Иследующегосостава, г: калий фосйорнокислый однозамещенный 3,0; аммоний хлористый1,0, вода дистиллированная 1000 мл.рН среды устанавливают добавлением10 раствора кальция гидрата,В минеральную среду дополнительновносят субстрат для окисления - кра 4ситель кислотный черный С в концентрации 25 мг/л, Субстрат для адсорбциибактерий вносят в минеральную средууказанного состава в количестве1 О об.Ф т.е, в опыте к 300 смсредыдобавляют 30 см Э субстрата.Адсорбцию культуры на субстратеосуществляют в процессе культивирова.ния в течение 48 ч при 30 С. Затем,закрепленные на субстрате клети бактерий отмывают дважды стерильным физиологическим раствором, .после чего субстрат с закрепленными клетками пере 8 4носят в 8 пробирок размером 25 хх 1,5 см в количестве 3 см и заливают 24 смЭ стерильного 0,8/-ного раствора хлорида натрия ( объемные соотношения субстрата и раствора 1:8 ),Культуру хранят при +4 С и прикомнатной температуре,По истечении определенных сроковхранения ( 6,9, 12 и 24 мес ) изучаютжизнеспособность и деструктивную активность штамма Рз, аегц(11 поэа КМ.Проверку жизнеспособности и деструктивной активности бактерий послехранения в условиях периодическогокультивирования осуществляют следующим образом,Для реизоляции бактерий после хранения субстрата с закрепленными клетками промывают 3 раза стерильнымФизиологическим раствором, растирают в стерильной ступке, а затем используют. как инокулят при посеве вминеральную среду М. После культивирования в течение 48 ч при 30 Спроизводят рассев на поверхность мясо-пептонного агара в чашках Петридля выделения чистой культуры.При проверке окислительной ( деструктивной ) активности бактерий используют суточную агаровую культуру,которую в дозе 500 млн, к-к/мл вносят в минеральную среду М, содержащую загрязняющее вещество - краситель кислотный черный С в концентрации 100 мг/л. Микробиологическое окисление осуществляют в процессе периодического культивирования при 30 С в течение 48 ч в стационарных условиях.Результаты деструкции учитывают методом фотоэлектроколориметрии на ФЭКпри М = 750"760 мм (красный светофильтр ) после осаждения микробных клеток центрифугированием притыс, об/мин в течение 8 мин.Культура бактерий Рэ. аегц 0(паза КМ после 6, 9, 12 и 24 мес. хранения независимо от температурного режима сохраняет способность к росту в минеральной среде Ми вызывает 98- 100-ную деструкцию красителя кислотного черного С ( таблица),П р и м е р 2. Осуществляют закрепление на субстрате и получение и хранение штамма бактерий деструкторов Рэ. Г 1 цогеэсепэ 2.Обработку рыбной муки и песка осуществляют как указано в примере 1.5 9813Муку и песок смешивают при следующем объемном соотношении компонентов, 1: мука 85;.песок 15. Для опыта берут 43 смЗ и 8 см З песка.Суточную агаровую культуру бакте- ю рий в дозе 500 млн к-к/мл вносят в минеральную среду М, в которую дополнительно вводят субстрат для окисления - краситель кислотный черный С в концентрации 75 мг/л.оАдсорбцию культуры на субстрате :осуществляют как указано в примере 1,Хранение осуществляют в 8 пробирках под слоем стерильного 1,0-ного раствора хлорида натрия при объемном 15 соотношении субстрата и раствора 1:10/3 см субстрата заливают 30 см раствора хлорида натрия, при +4 Со и при комнатной температуре.По истечении определенных сроков 20 хранения 1 6, 9, 12 и 24 мес ) изучают жизнеспособность и деструктивную активность штамма Рз. 1 цогезсепз 2, как указано в примере 1 загрязни- тель - краситель кислотный черный в концентрации 75 мг/л ).Культура бактерий Рз. 1 ЬогезсепзЯ2 после 6, 9, 12 и 24 мес хранения независимо от температурного режима сохраняет способность к росту в мине-ЗО ральной среде Ми вызывает 90- 100-ную деструкцию красителя кислотного черного С в концентрации 75 мг/л,П р и м е р 3 Осуществляют закрепление на субстрате и получение 35. и хранение штамма бактерий деструкторов Рз. зрес 1 ез б, предназначенных для очистки от формальдегида сточных вод химических производств.Обработку рыбной муки и песка осу-ев ществляют, как указано в примере 1. Муку и песок смешивают при следующем объемном соотношении компонентов,/; мука 82,5 песок 17,5. Для опыта берут 41 см муки и 9 см песка. 45Суточную агаровую культуру бактерий в дозе 500 млн к-к/мл вносят в минеральную среду М, в которую дополнительно вводят субстрат для окисления - формальдегид в концентрации в,100 мг/л. 58 6Адсорбцию культуры на субстратеосуществляют как указано в примере 1,Хранение осуществляют в пробиркахпод слоем стерильного 1,0-ного раст"вора хлорида натрия при объемном соотношении субстрата и раствора 1:9//3 см субстрата и 27 см растворахлорида натрия при +4 С и при комонатной температуре.По истечении определенных сроковхранения изучают жизнеспособностьбактерий, как указано, и деструкциюформальдегида в концентрации 500 мг/лколориметрическим методом с применением хромотроповой кислоты.Птамм Рз. зрес 1 ез 6 после 6, 9,12 и 24 мес хранения независимо оттемпературного режима сохраняет спо"собность к росту в минеральной средеМи вызывает 95-100/-ную деструкцию формальдегида,Схема опыта и сроки хранения биохимически активных бактерий представлены в таблице.Т.е, на примере 3 штаммов бактерийдеструкторов рода Рзецдощопаз установлено, что после 24 мес хранения пред-.лагаемым способом на новом субстратебактерии сохраняют высокую окислительную активность, что позволяет использовать их для микробной очисткиводной среды от токсикантов-загрязнителей после длительного хранения,Предлагаемое изобретение обуславливает социальный эййект, так как упрощает процесс хранения микроорганизмовВозможность использования бактерийдля микробной оцистки водной среды от токсикантов-загрязнителей после длительного хранения обусловливает экологический эффект в аспекте борьбы за 1охрану окружающей среды.Таким образом, реализация изобретения позволяет длительно хранить неспорообразующие бактерии рода Рзецдо" топаз, используя упрощенный способ хранения и обеспечить сохранение их биохимической активности.,о йо о х й о х оЭ Л: 1: у й о у оЭ Е г дно ойх эхо Е е 1о1 о о 1- о а 3 а а1 э о с 1 й а 1 х в 1 О 1 Х о с 1 а х 1 т2 а о х а аЮ о с а е е 1- О. у Щ а а сэо зк зх тагр вс у6 11-Х ЙХ 3о хой 1-о 5о с СВ :3 1- Э йО(.Э1о хХ 2х 1ар е фс уЭ1- Ело хПаолУ: Э о6 1- о1 Рй Ча Х в с а рй Щ Е о ао о л е -1. Субстрат для закрепления бактерий, содержащий песок, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью удлинения сроков хранения неспорообразующих бактерий рода Рзецдопюпаз, субстрат дополнительно содержит рыбную муку при соотношении компонентов, вес. ". оРыбная мука 80-85Песок 15-202. Способ получения неспорообразующих бактерий рода Рзеадогюпаз, предусматривающий адсорбцию бактерий в з дисперсном субстрате, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и удлинвния сроков сохра" нения биохимической активности бактерий рода Рзецдопюпаз, адсорбцию осу о ществляют в процессе культивирования бактерий с субстратом, в качестве ко 58 10торого используют смесь рыбной мукис песком, взятых в соотношении 4:1.5,7:1, внесенного в среду в количестве 103 с последующим отделением адсорбированной биомассы, промыванием еестерильным физиологическим раствором и помещением в стерильный 0,81,0-ный раствор хлористого натрияпри соотношении биомассы и раствора1;8-1:10,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Методы хранения коллекционныхкультур микроорганизмов. М., "Наука",1967 141-144,2. Авторское свидетельство СССРпо заявке Р 2781918/28-. 13,кл. С 12 М 1/00, 1979.31 цчеп В.1. А з 1 вр 1 е вейЬод Гог1 опц-Сегаргезегчай 1 оп о 1 зСос сы 1- Сцгез оГ 1 ас 11 ас 1 д Ьас 1 ег 1 а.рр 1. Васйего 1., 1979, 47, й 9Составитель Е, ВоробьеваРедактор А, Гулько Техреду О,Неце Корректор С, НекмарЗаказ 9633/36 Тираж 505 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретвний и открытий113035 Москва ИРаушская наб. д, 4/вью Ал 5 Йефилиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул.Проектная,