Способ получения ферментного субстрата на твердом носителе

/ ственный ноннтетсссрвм иэобретеннйоткрытий осуд И ностра Бликст, Св уйе Саленс(Шв цынтед Тернмарк, Ролм Тиру н Арв Манд лин,ная фирмас Кемикалеция) энд К 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ фЕРМЕНТНОГО СУБСТРА НА ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕпрочно ого субстрата,телем. В качесняют гель, целллей. При этомри которой субм ковалентной рмент снос ени вязанно юлоз им по олучатратвязью т носи и др. видьют комби ию вязан с носител рат легко удаляетс ме п тем воздейст вия ментле, где лимеркт еспечивают кон ным субстратэ вестного спэсо ть регулирэва ежду субстрат м ферментэм. алио фермен ыи мате м 1.ба явния носителя Некосатком и яется невозмож м и корост акции го соответствующ ью изо песенного субстрата, меж етствующим фер сэо нтэм достигается 2) Авторыизобрвтеиия Кьелл ГуннарКарл"Комма иди Изобретение относится к вопросам п или не связан с ним. В последнем случае субстсителя, напри р, уводой.Известен способ получения фного субстрата на твердом носив качестве носителя используют тения является получение твердый носитель ферментду которым и егосильное сродство и появляется возможность регулирования скорости реакциимежду ними.Для этого по предлагаемому способу конб тактмеждуферментнымсубстратоми твердым носителем осуществляют ацсэрбированием субстрата на носителе путемпогружения последнего в раствор ферментного субстрата в чистом раствори теле или в растворителе с добавками,причем после окончания процессаадсорбции растворитель упаривают,Предлагаемый способ заключаетсяв следующем;15 Твердый носитель суспендируют приперемешивании в субстрате или в субсграте и растворителе. Затем жидкость выпаривают и пэлученный эстаток тонко измельчают до получения частиц жела емого размера.Применяемый по этому способу носитель должен представлять сэбой твердоевещество, .химически инертное в этношении субстрата и иметь удельную пэвер. -висимости от времени и температуры,например, для пищевых продуктов, включая искусственно охлажденные и замороженные до низкой температуры. Если5,композиция, содержащая фермент исоответствующий субстрат, а также индикатор продукта, образующегося приферментной реакции, например индикаторрН, хранится в таких же условиях, как10 пищевой продукт, можно при соответствующей калибровке индикатора определитьсостояние хранящегося продукта по изменению цвета индикатора.П р и м е р 1. Тонкоиэмельченную15.ъокись кремния в количестве 100 г добавляют небольшими порциями, приперемешивании к 2500 мл хлористогометилена и получают гомогенную суспен 20зию. Ее смешивают со 100 г трикапролата глицерина, после чего смесь продолжают перемешивать в течение 1 ч прикомнатной температуре,Смесь продувают и удаляют хлористый метилен. При этом ее нагреваютИ одо 30 С, как только объем смеси уменьшится и станет равным 1500 мл нагревание прекращают,Продувание продолжают без нагревасмеси, обеспечивая при этом ее непрерывное перемешивание.Окончательное удаление хлористогометилена проводят в шкафу при 50 СЪи получают сухой хрупкий продукт белого цвета, который измельчают в ступке,просеивают через соответствующее ситои получают тонкоизмельченный порошок.Такой же результат получают при суспендировании указанного продукта в водеи последующей обработке его в колдоидной мельнице.П р и м е р 2. Тонкоизмельченнуюокись кремния суспендируют в хлористомметилене, как описано в примере 1. К5 этой суспензии при перемешивании добавляют смесь из 50 г трикапроина и 50 гверетенного масла и перемешивают ещев течение 1 час при комнатной температуре.50Затем удаляют растворитель, какописанов примере 1, и полученную массу измельчают. Получают порошкообразный носитель, покрытый раствором55субстрата.П р и м е р 3. Процесс полученияферментного субстрата на твердом носителе ведут по примеру 2 за исключениемтого, что к веретенному маслу добавля 3 656527ность, равную по меньшей мере 50 м /г.гили предпочтительно 200 м 2/г,Образующийся на носителе слой субст-.рата прочно с ним связан и содержитсубстрат, трудно растворимый в воде истабильный в отсутствии соответствующего фермента. Субстрат должен быть стабильным и не гидролизоваться или нерастворяться в отсутствии фермента, атакже должен быть труднорастворимымили нерастворимым в воде,В качестве субстрата согласно описываемому способу используют трикапронатглицерина (трикапроин), трипомергонин,трибутирин и бис,5-5 триметилгексиладипат, смещенные эфиры многоатомных спиртов и органических или неорганических кислот.Слой может, кроме того, содержатьрастворитель, смешивающийся с субстратом,Предпочтительными раэбавителями являются минеральные масла, содержащиенесколько углеводородов, высшие алифатические спирты, кетоны или эфиры иполигликолиПри другом осуществлении данногоизобретения указанный слой содержитвещество, изменяющее вязкость. Такимвеществом может быть, например стеараалюминия, агар,Предпочтительными носителями являются органические, неорганические полимерынеорганические окиси, кислоты или соли.Особо предпочтительным носителемявляется окись алюминия, карбонат кальция, карбонат магния, сидикааэрозоль илифосфат кальция.В качестве субстрата можно такжеиспользовать трикапронат глицерина.Предпочтительно в качестве носителяприменять аэрогель окиси: ,кремния.Степень доступности субстрата длявоздействия фермента можно изменятьпутем добавления к разбавителю добавокагентов, модифицирующих вязкость, например стеарата алюминия.Композиция субстрата, используемогопри осуществлении способа, пригоднаддя любой реакции, протекающей привоздействиисоответствующего фермента.Такой адсорбированный носителем,субстрат выгодно применять при стандартизации и характеристике ферментов.Специальной областью, в которой применение данного изобретения оказалосьнаиболее пригодным, является приготовление индикаторов, реагирующих в эа656527 ют 10% стеарата алюминия. Получают такой же продукт, как в примере 2,П р и м е р 4, Процесс ведут по. примеру 2 за исключением того, что применяют стеариловый спирт (вместо 5 веретенного масла). В этом случае для гомогенизации смеси трикапроина и стеарилового спирта ее нагревают. В остальном процедура не отличается от описанной в примере 2. 10П р и м е р 5, Проводят испытания покрытых субстратом носителей, приго товленных по примерам 1-3. При этих испытаниях определяют индикаторные свойства, зависящие от времени и темпе ратуры, в присутствии фермента липазы поджелудочной железы. Наличие кислоты, образующейся при ферментации, обнаруживают с помощью индикатора рН. Во всех случаях весовое отношение носителя к содержащему субстрат слою на указанном носителе равно 1:1. Полученные результаты показаны в табл. 1, где применены следующие обозначения: Р - флуосил, ТС - трикапроин,- веретен 25 ное масло, А 6 М - стеарат алюминия,Таблица 3 3 1 0,3 0,1 0,03 7,51537140380 11,34,511 ф 532 Из табл. 3 видно, что при комбинациисубстрата и носителя с большой удельнойповерхностью активность липазы увеличивается примерно в десять раз по сравнению с активностью при наличии только одного субстрата.П р и м е р 8. Проводят такое жеиспытание, как описано в примере 7, Здля сравнения активности энзима насубстрате без носителя и энзима, нанесенного на носитель. В качестве энзимаспользуют липазу поджелудочной железы.убстратом служит трипеларгонин ТР, а о носителем - флуосил 300 с удельной поверхностью, равной примерно 300 м /г.Используют продукт реакции, образующий-,ося при 20 С, в качестве меры активности.Подученные результаты приведены в табл.4 45 Т аблица 1-15 321 -20 1396 Пример 6 вия сгустителей (д пензии ферментного 0,25% агара к вод та (липаэа поджелу крытого субстрато в примере 1. Получ приведено в таб время изменения и С аблиц л. Табли 2 2 77 2 240 4 24 10 8 1,0 2,4 5,5 0,0 0 2 2,4 12,7 84 2 и м е р 9. Повторяют еру 8, за исключением П 133616000 32 13 роцесс ого, чт по Для изучения дейстобавок) в водной суссубстрата добавляют ной суспензии фермендочной железы) и пом носителя, описанного енное время индикации 2, как относительное Влияние агара сказывается при темпе"оратурах ниже -10 С.П р и м е р 7. Проводят испытания с целью сравнения активности при воздействии фермента липаза поджелудочной железы на субстрат (трикапроин) беэ носителя и на субстрат, нанесенный на носитель в соответствии с примером 1, При испытании применяют разные концентрации фермента, активность продуко та реакции, образовавшегося при 20 С, определяют с помощью индикатора рН. Полученные результаты показаны в табл. 3.656527 в качестве субстрата используют три- су пропионин ТРР, а не трипеларгонин. В ле качестве фермента применяют липазу ву поджелудочной железы, а в качестве го носителя - флуосил, Полученные результа п ты приведены в табл, 5. лу Таблица 5, "Рбстрата, адсэрбированногэ на носите, - суспензию, сэдержащую соответстющее количество кизельгура, покрыто 30% трикапроина. После добавленияутем смешения энзима (липаза поджедочнэй железы) обнаружили рН 5,4ои 20 С через 28 мин для субстрата,адсорбированного на носителе, и через220 мин для субстрата, неадсорбирован 1 О ного на носителе.Из сказанного выше видно, что присоответствующем выборе комбинациисубстрата, разбавителя субстратта, модифицирующего вязкость,15 субстрата и разбавителя, можноиндикатор время-температура.дикаторы применимы в условиях 0,5 1:2 2 в 5 32 16 а, агенсмесиполучить Такие ин, пригод 21 25 ных для хранения некоторых продуктов.Ввиду возможности придавать субстратуразличную конфигурацию, индикатор можно дополнительно приспособить при смешении материалов субстрата различныхвидов, например при смешении материала,который покрыт только субстратом, сматериалом, покрытым комбинацией субстрат-разбавитель-модификатор вязкостии т,д. При применении субстрата в соответствии с данным изобретением можноприготовить индикаторы, пригодные дляразных целей - для индикации фотоматериалов, медикаментов, пищевых продуктов и других чувствительных материалов, .которые требуют определенныхусловий хранения. е р 10. Процесс ведуза исключением того,трата применяют бисксиладипат (ТНА), а неВ качестве энзима испныне липазу поджелудкачестве носителя -примеру 8,-фгриметилгепеларгонин.ют как и ражелезы, а вПолученныетабл. 6. то в 2 О -3,5,5три- ользучнойфлу ос и. результаты приведены 16 3571192240-2 84 Как видно из примеров 8-10, при применении субстрата с носителем, имеющим большую удельную поверхность, активность значительно увеличивается по сравнению с достигаемой при применении субстрата без носителя.П р и м е р 11. Процесс ведут по примеру 7, за исключением того, что в качестве носителя применяют кизелгель С фирмы Мерк вместо флуосила. Этот носитель содержит 13% сульфата кальция, 0,02% хлорида, 0,03% железа и остальное - окись кремния. Диаметры гранул носителя составляют от 5 до 250 м. Для субстрата, неадсорбированного носителем, применяют 1%-ный раствор трикапроина в ацетоне, а для Способ получения ферментного субстрата на твердом носителе путем контакта ферментного субстрата с твердымносителем, отлич ающийс ятем, что, с целью регулирования скорос 45ти реакции между субстратом и егосоответствующим ферментом, контактосуществляют адсорбированием субстрата на твердом носителе путем погружения последнего в раствор ферментногосубстрата в чистом растворителе илив растворителе с добавками с последующим упариванием растворителя.Источники информации, принятые вовнимание при экспертизе1. Патент Франции. Ио 1306640,кл. В 01 Р, 1962. ираж 512 Подписно город, ул. Проектн ИИПИ Заказ 1585/5 филиал ППП Патент", г,ормула изобретен