Способ количественного определения хлордиазепоксида в биологических объектах

ОП ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕДЬСТВУСоюз Советскни Соцналнстнческнк Республнк(61) Дополнительное к авт. сеид-ву(22) Заявлено 250978 (21) 2667083/23-04с присоединением заявки Но -(51)М. Кл.з С 01 й 21/78 Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения И.В. Волкова и Б.Н, Изотов Первый Московский ордена Ленина и ордена ТрудовогоКрасного Знамени медицинский институт имени И.М, Сеченова(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРДИАЗЕПОКСИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХИзобретение относится к области аналитической химии, а именно к способам количественного определения хлордиазепоксида в биологических объектах.Известен способ количественного определения хлордиазепоксида, заключающийся в обработке анализируемой пробы буферным раствором до рН среды 7,2 и экстрагировании эфиром, упари вании эфирного экстракта и обработкой полученного сухого остатка глициновым буфером до рН 4,8 и нагревании на кипящей водяной бане с последующей обработкой буФером до рН 7,2 15 и экстракции плактамоэфиром отделением и обработкой эфирного слоя раст" вором едкого натра, облучением дневным светом и спектрофотометрированием полученного раствора Г 17, 20Недостатком способа является невысокая точность определения.Наиболее близким к описываемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является 25 способ количественного определения хлордиазепоксида в биологических объектах, который заключается в изолировании из гомогенизата объектов исследования 0,1 н раствором соляной 30 2кислоты (трехкратная мацерация органов), экстрагирование органическими растворителями полученной вытяжки из органов при значении рН, равном 2, эфиром (трижды порциями 25 х 15 х 15) с последующим подщелачиванием ее до рН 10 и повторной экстракцией хлороформом из щелочного раствора; хроматографию упаренных экстрактов в тонком слое сорбента, элюирование слоя сорбента, содержащего анализируемое вещество, органическим растворителем; упаривание растворителя, гидролиз 6 н-ым раствором солянойо кислоты сухого остатка при 120-130 С, экстракцию полученного гидролизата органическим растворителем, хроматографическое разделение в тонком слое сорбента и элюирование 2-амино- хлорбензофенола и проведением азосочетания 2-амино-хлорбензолфонона с И- нафтилэтилендиамина дигидрохлоридом и спектрофотометрированием окрашенного продукта 123. Недостатком способа является его сложность, связанная с многократной зкстракцией, использованием большого количества токсических органических растворителей, применением двухкрат 79211660 ной хроматогр.1 фии; длительность (до2 - х суток), невысокая чувствитель -ность (граница обнаружения 0,2 мг в100 г объекта).Целью изобретения является упрощение способа и повышение чувствительности определения.Поставленная цель достигаетсяописываемым способом количественногоопределения хлордиазепоксида в биологических объектах путем гидролизанепосредственно анализируемой пробыраствором соляной кислоты при 100110 С с последующей экстракцией полу.ченного гидролизата органическимрастворителем и хроматографированииполученного экстракта в тонком слоесорбента, элюирования бензофенонови проведения азосочетания с М-К-нафтилэтилендиамином и дигидрохлоридоми спектрофотометрирования полученного при этом окрашенного раствора,Отличительным признаком способаявляется то, что гидролизу подвергается непосредственно анализируемаяпроба при 100-110 С,Примеры иллюстрируют предлагаежй способ.П р и м е о 1. К 25 г гомогенизата каждого отдельного органа (печень, желудок с содержимым, кишечник, почки) в круглодонной колбе спритертои пробкой емкостью 140-200 мпприбавляют о 100 мл 6 н раствора соляной кислоты и гидролизуют в течение 2 ч при 100-110 С на глицериновой бане с обратным холодильником,По окончании гидролиза обратные холодильники промывают 3-5 мл 2 н раствора соляной кислоты, присоединяяпромывные воды к гидролизату, который Фильтруют через ватмановский(бумажный) фильтр (" белая лента) вделительную воронку.фильтрат нейтрализуют, добавляягранулированный едкий натр, и доводят рН раствора до 10 по универсальному индикатору.2-амино-хлорбензофенон, полученный в результате гидролиза, экстрагируют н-гептаном трижды порциями 20, 15, 15, Гептановые извлеченияпосле расслоения фаз переносят вмерную колбу на 50 мл, пропускаячерез воронку с безводным сульфатомнатрия (1-1,5 г). В случае образования эмульсии, с целью расслоенияфаз, проводят центрифугирование втечение 5-10 мин. при 5000 об/мин,Объем раствора в мерной колбе на 50 мл доводят гептаном до метки и тщательно перемешивают.Хроматографическое определение бензофенона хлордиазепоксида от бено зофенонов других производных 1,4- бензодиазпенина и их обнаружение,По 10, мл полученных гептановых извлечений выпаривают при комнат 5 10 15 20 25 30 35 40 а 5 50 55 ной температуре или на роторномиспарителе в выпаривательных колбахдо объема 0,5-1 мл, остатки наносятна стартовую линию хроматографической пластинки с тонким слоем силикагеля КСК (0,62 на 1 см, от250 меш.), закрепленного гипсом(5 от веса силикагеля) в виде 2-хполос (в каждой 10 мп выпаренногоэкстракта) длиной в 1 см на расстоянии 2 см друг от друга, Рядом на туже стартовую линию наносят пятнометчика, состоящего из смеси 0,1этаноловых растворов бензофеноновпроизводных 1,4-бензодиавенина(диазепама, нитразепама, хлордиазепоксида) в количестве 10-15 мкгкаждого бензофенона. Хроматографируют в системе бензола. Пробег фронтарастворителя 10 см. Время хром-.тографирования 20-25 мин, С хроматограммыудаляют органический растворительпод током теплого воздуха (Феном)5 мин,Часть хроматограммы, соответствующую первой полосе исследуемого раствора, предназначенной для элюирования, закрывают стеклянной пластинкой.На открытой части хроматограмьы с пят.ном метчика и 2-ои полосой исследуемого раствора проводят реакцию образования азокрасителя, С этой цельюхроматограмму опрыскивают последова.тельно 2 н-ым раствором соляной кислоты, 0,1-ым раствором нитрата натрия, через 5 мин избыток нитрита натрия удаляют обработкой пластинки 0,5раствором сульфамата аммония и через1-2 минуты полученную соль диазониясочетают с 0,1-ым раствором Н-К-нафтилэтилендиамина.В случае присутствия 2-аминохлорбензофенона (продукта гидролизахлордиазепоксида) на хроматограммечерез 15 мин образования пятно сиреневого цвета (бензофенон нитрдзепамадает пятно разового цвета с й 0,16)сравнивают величину Н метчика хлордиазепоксида (0,27-0,3) и исследуемого раствора. Реакцией удается обнаружить 1 мкг хлордиазепоксида в пятне,Из закрытой части пластинки зонуселикагеля, соответствующую расположению пятна метчика, собирают настеклянный фильтр Р 4 и элюируютдвумя порциями этанола по 5 мл вмерную пробирку. Элюат доводят этанолом до 10 мл. Снимают спектр 2-,амино-хлорбензофенона в Уф области(от 200-400 нм) в кювете с толщинойрабочей поверхности 1 см на СФ,Наличие характерных максимумов поглощения в области 238 нм и 390 нм подтверждает присутствие соединения в исследуемом растворе (Е " /см = 980).7Этаноловый раствор бензофенонапосле снятия спектра количественнопереносят в стеклянный бокс, туча/ плотность;я раствора,птическаяонцентрацес ;олщина пом де лощающего слоя,Способ позв и повысить чув ления с 0,2 мг 0,05 мг в 100 же присоединяют раствор, оставшийся в мерной пробирке. Этанол упаривают под током теплого воздуха, а остаток растворяют в 5 мл 2 н-ой соляной кислоты при постоянном помешивании в течение 10-15 мин. В зависимости от концентрации в полученном растворе 2.-амино-хлорбензофенона, которую ориентировочно рассчитывают после снятия спектра в УФ, на реакцию образования азокрасителя берут 0,5,1,0 или 3 мл и доводят (если это необходимо) до 3 мл 2 и-ым раствором соляной кислоты. Далее последовательно добавляют 0,5 мл 0,1 раствора нитрата натрия, через 5 минут - 0,5 мл 0,5 раствора сульфамата аммония, Азокраситель сиреневого цвета образуется через 15 мин после добавления 1 мл 0,1-го раствора М-о-нафтилэтилендиамида дигидрохлорида. Окраска устойчива в течение сутоОптическую плотность окрашенного раствора измеряют на спектрофотометре СФпри 550 нм в кювете с рабочей длиной поверхности 1 см. В качет-, стве раствора сравнения используют контроль реактивов. Концентрацию хлордиазепоксида в органах определяют по формуле: Х - содержание хлордиазв 25 г органа;0 - оптическая плотность измеряемого раствора;Ч - объем разведенного гидролизата (50 мдд);Ч - количество аликвоты гепта 2нового экстракта, взятого для нанесения на хроматографическую пластинку (10 мдд); Ч - количество 2 н-го растворсоляной кислоты, взятого на растворение сухого остатка;Ч, - количество аликвоты, взятой на реакцию солянокислого раствора;6 /сг удельный показатель поглощения;навеска исследуемого органа.Количество хлордиазепоксида, выделяемого из 25 г органов, представлено в таблице.Методика: Из стандартного растьо-, ра хлордиазепоксида в этаноле(1000 мкг/мл) готовили серию растворов в мерных колбах на 25 мл, содержащих 20,50,100,150,200 мкг/мдд. К 0,5 мл этих растворов, помещенных в колбу для гидролиза, добавляют по 3,0 мл 2 н-го раствора соляной кислоты и гидролизуют 20-25 минут при 100- 110 ОС на глицериновой бане с обратным холодильником. Охлажденный гидролизат доводят в мерной пробирке до 5 мл. 2 и-ым раствором соляной кислоты и 1 мл из этого раствора берут на реакцидо образования азокрасителя (реакция Браттои-Маршалла), описанную выше. После определения плотности окрашенного раствора наспектрофотометре СФпри 550 нм вычисляют удельный коэффициент поглощения по формуле: ляет упростить процес твительность опредев 100 г объекта до объекта.792116 Определение количества хлордиазепоксида 46,5 93,0 Х = 48,5 97,0 )(=,370 0 0,0 х/п формула и ретения нного в био анием сдоты экстра органи атогра пределеогических 60идролиэари нагрецией полуескимированием 6 Способ количестве ния хлордиазепоксида объектах с использов раствором соляной ки ванин с последующей ченного гидролизата растворителем и хром 0,189 0,183 0,194 0,180 0,198 99,5 9 91,5 9 97,0 9 90,0 9 99,0 9 полученного экстракта в тонком слое сорбента, элюированием бензофенолов ипроведением аэосочетания элюата с й-а-нафтилэтилендиамином дигидрохло ридом и спектрофотометрированием полученного при этом окрашенного раствора, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения чувствительности опреде792116 10 ения, гидролизу подвергают непосредственно анализируемую пробу при.емпературе 100-110 С. 3с Составитель Л. Солом."еваРедактор Т. Морозова ТехредМ,Табакович Корректор О. Билак Заказ 9431/42 Тираж 1019 ВНИИПИ Государственного по делам изобретений 113035, Москва, Ж, РаушскаяПодписноекомитета СССРи открытийнаб д. 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Источники информации,)ринятые во внимание при эксгертизе1 ВегпагЬ А, КоесЬ 11 п апЬ 1.цспв)фАгсопйе. пбейегв 1 пасоп оГ СЬ 1 ог 1 алерох 1 Ье апЬ оГ а ИейаЬо 1 йе оГ)одв апЬ Кайв Ьу а врес 111 с вресг.го 1 цогоае югс И 1 сго Ие сЬоЬ" Апаусса 1 Восмаеввйгу, 1963, 9 5, р.195-207.2. Сборник фОпределение физиологически активных веществ и их метаболитов в биологических объектах" под редакцией А.И. Тенцовой и М.Д. Швайковой.Изотов Б.Н. и др. "Изолирование хлордиазепоксида из внутренних органов трупа", 1977, с. 20-24 (прототип).