Способ получения -лизина

)И. Кл,С 12 Д 13 Государственный коинт ссср оо делам нзобретеннй и отнрьтнйописания 08,01,7 а оп Иностранцынака, Есио НакаКецдзи Такахара (Япония) Авторыиаобретен Кодзи Асахи оси Сираиси Тутому абусики Кайся Инос Канпгафучииная фирмаагаку КогиЯпония) 1) Заявит ПОЛУЧЕНИЯ Ь - ЛИЗИНА м в качестве источник углели жир,ри ас зуют животноельное масло,ода испли расти цка г угеозу т ил, в качестве исьзуют т 1 -алкая, 9 атомов углеырую нефть, сотредлазцна из аммыЙ 22323 15 Ь -(2 Изобретение относится к технике получения Ь -лизина путем культивирования бактерий вида МО С, о р д 1 а на питательной среде.Известен способ получения Ь -лизина путем культивирования продуцирующих его микроортанизмов рода й О Са гй 1 а в условиях аэрации на питательной среде содержащей источник углерода, азота и необходимые питательные соли с последующим выделением 1 -лизина 1 .Недостатком известного способа является то, что он не обеспечивает достаточно высокого выхода , -лизина.Белью изобретения является повышени выхода , -лизина,Это достигается тем, что в гаемом способе получения ,- ли рода ИОСОГД 1 Се используют шИоссц й 1 о аИопоц 1 о 0 ттаоьсе 59 (АТСС 31220) и И.2 (АТСС 31221), устойчивые к-аминоэтил) Ь - цис тину,Кроме того, в качестве источи улерода используют жирную кислоту,Кроме того, в качестве источника углерода используют этиловый спирт.Кроме того, в качестве источника1 О лерода используют глюкозу ипи фруктили крахмал, или продукт гидролиза мелассы или крахмала.Кроме того, в качестве источника углерода используют уксусную кисло у иЦ лимонную кислоту,А также, кроме тоготочилка углерода исполсодержащий от 14 до 1рода или керосин, или с20 держащую тт алкан,При этом рН питательной среды после культивирования микроорганизмов доводят до 1-3 и выдержаивают в течениео5-120 мин при 80-100 С,35 Кроме того, рН питательной средыпосле процесса культивировании микроор,ганизмов доводят до 7-9 и выдерживают от 5 минут до 5 суток при 80100 С. 5Способ осуществляют следующим образом,Продуцирующие 1 -лизин микроорганизмы иэ рода ИОсОгЖокультивируютв условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, азотаи необходимые питательные соли,Иэ рода ЙОСОгд 1 О используютштаммы Мосои 3(О ОИойОЯВоМОоиьо.% 22359 (АТСС 31220) и22315 (АТСС 31221), устойчивые к 5-(2-аминоэтил) Ь -цистину (АЕС),Микробиологические свойства указанных штаммов аналогичны микробиологи 20ческим свойствам исходного штамма223, за исключением того, что первые два штамма обладают стойкостьюк АЕС, а последний нуждается в помосерине.Морфология, Форма, Ранняя стадиявыращивания: 0,8-1,0 х 4-15, прямыеили изогнутые палочки, отмечается наличие ответвлений; стабильная стадия:сферическая или короткая палочкообраз30ная, близкая к форме сферы,Грам-травление положительное, быстрое кислотное травление отрицательное,подвижность отсутствует,Зндогенные споры отсутствуют клет 35ки на стойкой стадии выращивания выдероживают при 80 С одчочасового нагревав физиологическом растворе.Условия выращивания;Колония выращена на агаровой плас, отинке в течение 3 суток при 33 С, форма округлая, рост хороший; окраскабледно-розовая, колония непрозрачная,влажная, гладкая.Культивирование на скошенном агареов течение 3 суток при 33 С, колониянитевидная, рост хороший, окраска бледно-розовая, колония влажная, гладкая,наличия воздушного мицелия не отмечается.50Культивирование на питательном бульооне.при 33 С, На поверхности образуетсятонкая пленка, отмечаются осадки,Питательная желатина не ожидается,выращивание на поверхности и в верхнейчасти,Локмусовое молоко: щелочная реакция беэ коагуляции или пептизапии,Филиологические свойства, Крахмалне гидрализует, восстанавливает нитраты, индол образует, сероводород образует, уреазу не образует, проба М Р.отрицательна, испытание метилкрасным отрицательно, реакция на каталазу положительная, целлюлозу не разлагает, потребность в питательной среде отсутствует,разложение дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДА) отсутствует, чувствительность клизоцину имеется, эскулин разлагает,к пеницилчину ( 5 единиц/мл, метод диска)не чувствителен.Ассимилирует в качестве источникауглерода фруктозу, глюкозу, маннитол,сорбитол, фенол, молочную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, апетамид, тирозин, этанол, маннозу, й-алканы,;текстрин, масла и жиры, жирные кислоты,Образование кислот из сахаров; кислоты образуют из глюкозы, фруктозы, сорбитола маннитола, глицерина и трехалозы, осьсутствует образование кислот из ксилозы,галактозы, сахарозы, лактозы, мальтозы,инозитола, декстрина и крахмала,Оптимальная температура выращиваония от 30 до 37 С, рост наблюдается водиапазоне 10-40 С рН роста 8-9, аэробен относительно кислорода. Состав клеток, Содержит Хф-диаменопимеловую кислоту, галактозу, и арабинозу.В питательной среде в качестве источника углерода при выращивании используют животное масло или жир, растительное масло, жирные кислоты, этиловыйспирт, глюкозу, фруктозу или крахмал,пли продукт гидролиза мелассы или крахмала, уксусную или лимонную кислоту,И-алканы, содержащие 10-30 атомовуглерода, а также углеводороды, такиекак керосин и неочищенная нефть.В качестве источников азота используют ацетат аммония, сульфат аммония,хлористый аммоний, нитрат аммония, водный раствор аммиака, аминокислоты,смесь аминокислот, экстракт дрожжей,пептон и экстракт мяса, При необходимости вводят также соли неорганическихкислот, такие как фосфаты, соли кальция, магния, калия, натрия, железа, марганца, цинка и следы других металлов,Эти компоненты питательной среды вводят до стерилизации или отдельными поршими в процессе ферментацип,Выращивание осуществляют со встряхиванием или при аэрации и перемешива5 мл полученного бульона вводят в 2 литровую колбу Сакагучи, содержааую 200 мл такой же питательной среды, как в примере 1. Выращивание осуществляют в течение одних суток при ЗЗ С со встряхиванием. 600 мл полуоченного бульона переносят в .30 - литро вый сосуд, содержащий 10 мл производящей Ь-лизин среды указанного ниже состава, Культивирование проводят при ЗЗ С с перемешиванием при 400 об/мин и с пропуском 9 л воздуха в минуту, В процессе культивирования среду нейтрализуют водным раствором аммиака до рН 7,0, Спустя 96 часов культивирования получают 52,5 г/л ь -лизина ( в виде гидрохлоридов), К 1 л полученного бульона добавляют концентрированную серную кислоту, до достижения рН 1 5, Затем осуществляют нагрев при 100 С в течение 20 мин и фильтрацию, Фильтрат пропускают через иопообменную смолу типа . 1 Й, МН ", адсорбирующую 1 -лизин, Затем промывают водой и элюируют аммиаком. Элюированные фракции подвергают сгущению, нейтрализации,концентрированной соляной кис= лотой и сушке. Получают 45 г гидрсхлорида Ь-лизина со степенью чистоты выше 98%.Состав производящий Ь -лизин средьг. алкан (С 4 - С 1 )100 г.Сульфат аммония 35,0 г СаСЕ 2 Н О 1,0 гНаС 1 1,0 гНРО, 1,0 гКй РО1,0 гМ ЯО, 7 Н 0 0,5 г ре 80 7 Н 0 100 мг Мирло, 4 н о 0 мг Хп 50, 7 Н 20 мг Вода из водопровода 870 млрН 7,0Температура 120 С (парообразование в течение 15 мин)П р и м е р 6. К 1 л полученного в примере 5 питательного раствора добавляют необходимое для доведения рН до 11 количество гидроокиси кальция,о Раствор нагревают ЗО мин при 100 С, а затем в течение двух часов через него пропускают воздух, рН раствора доводят добавкой концентрированной серной кислоты до 5,0. Затем раствор фильтруют, Фильтрат пропускают через ионообменцук.2,0 80 80 О 5 Элюированные фракции подвергают сгущению, нейтрализуют концентрированной соляной кислотой и сушат, Получают 46 г-лизина (в виде гидрохлорида) с чис тотой, превышающей 88%.П р и м е р 7, Выращенные в течение одних суток при 33 С в бульоне на скошенном агаре бактерии ЙОсдс)н а%опод 60 ОиоцбО223-15 О (АТСС 31221) петлей высевают в 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую ЗО мл питательной среды, аналогичной по составу- среде, упомян той впримере 1, за тем исключением, что вместо П-алкана используют глюкозу, Культивирование ведут в течение четырех суток при ЗЗ С, Количество накопленного в среде-лизина составляет 0,5 г/л ( в ви- де гидрохлорида).П р и м е р 8, Выращенные на скошенном агаре бактерии ИОСО 1 дд 10 оИ:о поД 1 ООРООЬО, 223-15(АТСС 31221), культивирование велось С о в течение 1 суток при температуре 33 С, петлей вводят в 500-миллиметровую колбу Сакагучи, содержащую 30 мл среды, аналогичной по составу среде, использованной в примере 1, за .тем исключением, что вместо И -алкана ввсдят уксусную кислоту порциями, не превышающими 0,%. Далее выращивают в течение четырех.,о, 1" суток при 33 С, со встряхиванием. Количество полученного в виде гидрохлоида Ь -лизина составляет 22 г/л.П р и м е р 9, Штамм ИОСОРЙО Од,- 1 ойодбиОпоо во223-59 (АТСС 31270), продуцируюший Ь-лизин, выращивают в питательной среде, содержащей н-парафин, включающий 14-19 атомов углерода, в качестве основного источника углерода, Питательный жидкий бульон разделяют на порции по 20 мл каждая. Величину рН разделенного питательного бульона регулируют, доводя до 1,5; 2,0; и 3,0, и осуществляют нао грев при 80 С 5 мин, при 80 С -о10 мин, при 100 С - 2 часа, фильтраццю осуществляют с использованием 51 стеклянного фильтра ЗСиспиратора, результаты представлены в таблице,,0 100 ,5 100 ,5 100 5 2 0 ения изо та мпо пп,2-9,ятые во иоритет по.75 по и. 1; 22 точники информаци ие ири.экспертиз Акц, заявка Япон 12 З 13/06, 19/59 Тираж 527ЦНИИПИ Государствио делам изобрете13035, Москва, Ж.35 Подписноеиного комитета СССний и открытийРаушская наб д, 4 ал ППП Патент, г, Ужгород, ул. Проектная 1, Способ получения ь-лизина путем культивирования иродуцирующих его микроорганизмов рода МОСОг(31 о в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник углерода, азота и необходимые питательные соли с последующим выделением Ь-лизина, о т - л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода, из рода ЙОСОГд 1 а используют штаммы ИосагФО аИ(ароЯСо 11 ооцьО М 223 59 (АТСС 31220) и Хо 223 15 АТСС 31221), устойчивые к б -(2- -аминоэтил) Ь -цистину,2, Способ ио п, 1, о т:л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве источник углерода используют животное масло или жир, или расТительное масло. 3, Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве источника углерода используют жирную кислоту. 4, Способ по и. 1, о т л и ч а ю- щ и й с я тем, что в качестве источника углерода используют этиловый спир5. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве источуглерода используют глюкозу илиозу, или крахмал, или продукт гида мелассы или крахмала,6, Способ по и, 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве источника углерода используют уксусную кислоту или лимонную кислоту.7. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве источниго ка углерода используют п-алкан, содержащий от 14 до 19 атомов углеродаили керосин, или сырую нефть, содержащую и -алкан,8, Способ по и. 1, о т л и ч а кг35 щ и й с я тем, что рН питательнойсреды после культивирования микроорганизмов доводят до 1-3 и выдерживуотв течение 5-120 мин при 80-100 С,9, Способ по п. 1, о т л и ч а ю 30 щ и й с я тем, что рН питательнойсреды после процесса культивированиямикроорганизмов доводят до 7-9 и выдерживаюот от 5 минут до 5 суток при80-120 С,3 П