Способ получения ферментационной жидкости, содержащей витамин в

Оп ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК ПАеЕНЗУ Союз СоввтсеаСоциалистицвскихРеспублик(33) ВНР ритет Гасударственный нсинте Вевета 1 енннс 1 рав СССР ее делам нзобретеннй н етнрмтнй(45) Дата опубликования описания 05.08,77 ст ранцыер, Тамаш Сонтаг, Ласло Кути,Бекеш, Депеш Секель, Янош КишаКовач и Анико ХлргятйяВНР)приячие Ин Беда Иохан, Ласло Се Эмилия Шимоновнтш, КЬит Эржебет72) Авторы изобретеии Инопред(71) Заявител р РТ 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАЦИОННОИ ЖИДКОСТИ СОДЕРЖАЩЕ 13 ВИТАМИН В, гИзобретение относится к микробиологическойпромышленности и касается способа полученияферментационной жидкости, содержащей витамин В, е повышенной концентрации,Известен способ получения витамина В либо 5путем стерильной ферментации монокультур, либос помощью смешанных бактериальных популяций,выделенных из сточных вод и приспособленных кспециальной питательной среде 111,Однако нри использовании смешанных бактериальных популяций выход витамина В,1 нельзяувеличить за счет повышения индивидуальнойпроизводительности отдельных видов бактерий,как зто обычно имеет место при стерильной фер.ментации монокультур, 15В смешанных популяциях метаболизм отдельных видов микроорганизмов может быть независимым, но не от любого нз других присутствующихвидов. Это взаимодействие в некоторых случаяхможет носить как положительный эффект - в 20результате чего повышается выход требуемогопродукта, так н отрицательный, например, в процессах септической ферментации, где обычные инфи.цирующие бактерии не могут размножаться в фер.ментацнонных жидкостях, И Известен способ получения ферментациоиной жидкости, содержащей витамин В,е, путем анаэробной ферментации смешанной культуры анаэробных метановых бактерий на питательноЙ среде в присутствии метанола 121.Недостатком указанных способов получения в настоящее время витамина В,е в процессах ферментации, проводимых с метанпроизводяшими является то, что получаемые ферментационные жидкости содержат всего лишь 10000 - 11500 мкг/л витамина В, .Целью изобретения является разработка такого способа, который позволил бы значительно синхронизировать цикл размножения бактериальной мас. сы в ферментационной жидкости и увеличить концентрацию бактерий в ферментационной жидкости и тем самым повысил бы выход витамина В, е. Цель достигается тем, что в известном способе получения ферментационной жидкости, содержащей вита мнн В получаемой путем обычной анаэробной септической ферментацнн со смешанной метан. производящей бактериальной популяцией фермен. тацию осуществляют постадийно: на первой стадии проводят отбор ферментационной жидкости в количестве 5 - 15%, преимущественно 10%, с за.,80 304 326 3меной се концентрированной питательной средойсодержащей необходимые питательные вещества,предпочтительно десятикратной концентраци", иметанолом в количестве 0,5-1,5 аб,%,на второй стади, преимупственно через 24 ч,ферментационную жидкость не отбирают, а добав.ляют только лишь метанол в количества 0,5 - 1 )5 об.%,на третий стадии - в последующие 5 - 10 днейвновь осуществляют отбор 5 - 15 о ферментацнониой жидкости с добавлением 0,5 - 1,5 об.% метанолаи соответствующего отобранному количеству жид.кости объема питательной среды.При этом концентрированную питательную средцелесообразно вводить при р 11 среды, преимущест.венно равном 5,5 - 5,8.Благодаря такой последовательности в постадийиой подкормке Обеспечив яс тся постепенноесиюсроБиэирование цикла размножения Всех быкте.риальных популяций, и результатс чего постепеннонарастает концентрация бактерий н соответственноэтому тякже концентрация витамина В р и ферментацнонной жидкости,Высокаяконцентрация бактерий в фермен.тационной жидкости может быть досттсгнута такжеж счет того, что из другой ферментацнонной жнд.кости, получаемой благодаря осуществляемой извасиным методом ферментации, отделяют живыебактерш, например, це ггрифугированием и готовятконцентрат бактерначыыч клеток примерно с д 48Таким образом, из таблицы видно, что необходимое количество метанола для ежедневной добав. ки в пеоесчете на весь объем ферментацнонной жидкости составляет 0,4 - 1 5 об, о,Предлагаемый способ имеет преимущества перед известными: позволяет получить высокие концентрации витамина В, в ферментацпонной жидкости порядка ЗО ООО - 40 ООО мкг/л, позволяет применять смешанные бактериальные популяцпт в промышченных ферментационньис процессах,П р и м е р 1, Цля проведения процесса фермен. тащп 1 берут ферментаторы с лолезюпч объемом 10 л каждый, снабженные трубками для отвода 80000-90000 мкг/л витаьжна В, а. Получаемый концентрат добавляют в фермеитационную жил; кость, являющуюся исходнои средой, с таким рас.,четом, чтобы концентрация витамина В,а в среде достигала требуемого значения, например 30000 мкг/л. После этого можно сразу же перейш на полунепрерывную постадийную фермеитацию,Важную роль в предлагаемом способе играетдозировка метанола, вводимого как в подготови О тельных фазах способа, так и во время продолжающейся согласно изобретению полунепрерывной ферментации в ферментационную жидкость. Про.делаиные опыты подтвердили, что имеется однознач.ная и линейная взаимосвязь между количествами ежедневно вводимого метанола и выделяемого так называемого бногаза, по объему которого в единицу времени можно однозначно судпь о количестве мета иола, потребляемого бактериями. Поэтому целесооб разно вводить метанол порциями, которые необто ходнмы только для замены потребляемого коли.чества, поскольку избыточная дозировка может привести к скоплению метанола в ферментационной жидкости, а избыток метанола может оказывать" токсичное воздействие на популяцию бактерий.2 Табл. 1 показывает эту взаимосвязь в пересчете на1 л ферментационной жидкости. С йомощью этой таблицы можно, исходя из объема газа, получаемого в 1 л ферментационной жидкости за 1 ч, опреде.лить количество метанола, которое необходимо Зо вводиь ежедневно в ферментациониую жидкость.Таблица 1 газа, и заполняют соответственно 10 л фермента.ционной жидкости, получаемой, известным спосо. ф бом путем олунепрерывной фермеитащи со сме.шанной мсзофильной метанпроизводящей популяцией и содержащей 9940 мкг/л витамина В, Согласно изобретению в исходную среду вводят добавку при одновременном отборе такого же зз количества фермепациониой хсидкости) питательной среды следующего химического состава:Концентрат кукурузногожидкого экстракта, г/л 5 Гидролизат ннвных дрожжей, мл/л 1 60 Меласса, г/и 210 10 Отработанный сульфатныйщепок, г/л 1,6Экстракт печени, 10% в н, г/л 1Гидроокнсь аммония, 24%-ная, мл/л 1,1Ъиаммониевый гидрогенфосфат, г/л 2 5Гидрокарбонат аммония, г/л 3Сульфат аммония, г/л 1,5Гидросульфит натрия, г/л 0,02Хлорид магния, г/л 0)1Хлорид кобальта, г/л 0,01 1 оАнгидрид янтарной кислоты, г/л 0,006Глицин, г/л 00065,6 . Диме тилбензимидазол, г/л 0,003Наряду с этой питательной средой, называемойЙВов ферментационную жидкость (рабочую среду)ежедневно вводят 0,6 об.% метанола. Ферментеры Аи В заполняют соответственно каждый 10 л фермен.тационной жидкости, выдерживают прн 32 - 34 С ив течение трех дней вводят в иих ежедневно лишь50 мл метанола, На четвертые сутки отбирают 1 лферментационной жидкости и вводят такой жеобъем концентрированной питательной среды следующего состава (НВ,0):Концентрат кукурузногожидкого экстракта, г 50Гидролизат пивных дрожжей,20 ный, мл 10Меласса, г 20Отработанный сульфнтныйщелок,гЭкстракт печени, 10% - ный, млГндроокись аммония,24% - ная, мл 11Диаммониевый гидрогенфосфат(двухэамеще нный фосфорнокислыйаммоний), г 20Гидрокарбонат аммония, г 30Сульфат аммония, г 15Гидросульфат натрия, г 1,0Хлорид магния, г 1,0 40Хлорид кобальта, г 0,1Ангидрид янтарной кислоты, г 0,06Глицнн, г 0,065,6 . Диметилбензомндазол 0,03Вода, мЛ До 10005Предварительно замеряется объем газа, выходящего через газоотводную трубку, и, посколькуколичество газа, образуемого за час, в пересчете на1 л фермепацнонной жидкости составляет примерно 160 мл,то одновременно с питательной средой ЙВ,0 вводят так же и 70 мл (0,7 об.%) метанола, В последующие 5 дней, т.е, на 5, 6, 7, 8 и 9-есутки опыта вводят только добавку метанола безотбора жидкости, а именно в количествах, соот.ветствующих скорости выделения газа согласнотабл, 1. На десятый день снова отбирают 1 л ферментацнонной жидкости, добавляют 1 л пнтатель.ной среды ЙВ,0 и соответствующее количествометанола. То же самое повторяют и на 17 - ый и25-ый день, причем в промежутках - в 11, 12, бп13-ый днн и далее в 18, 20, 21, 22, 23 и 24-ый дии снова вводят без обора ферментационной жнд. кос 1 И лишь соответствующие ккичества метанола.С 25 дня начинают осуществлять полунелре. рывную ферментацию. На 26-ой день добавляют только метанол беэ отбора жидкости, затем с 27 по 32 день отбирают ежедневно 1 л ферментацион. ной жидкости, добавляют 1 л питательной сре. ды ИВ, и необходимое количество метанола, на 33 - ий день после отбора 1 л ферментационной жидкости снова вводят 1 л питательной сре. ды йВ, о. Далее цикл повторяется.В течение времени, а именно с 25 по 75 день, определяют содержание витамина В,1 в отобранной ферментационной жидкости, Прн этом имеет место лишь незначительное расхождение концентрации витамина В, з в фермепационных жидкостях, сред. ние значения составляют, мкг/л:для ферментера А 43268 для ферментера В 43543П р и м е р 2. Способ осуществляют согласно нримеру 1, но с той лишь разницей, что на 4-ый день осуществляют полунепрерывную фермента. цию, как в 25 - ый день, по примеру 1, В этом случае концентрация витамина В, в ферментационной жидкости, получаемой известным способом и используемой в качестве исходной рабочей среды, составляет 10 600 мкг/л,Наряду с периодически чередующейся добавкой питательной среди МВ,е и соответственно ЙВ, ежедневно вводят следующие количества метанола:День опьпа Метанол, мл3 - 9 8010 - 12 100 13-14 12015 130 16 140 17 150Ежедневно вводимые в процессе опыта коли чества метанола выбирают по табл, 1.В этом опыте непрерывно определюш соцер. жанне витамина В, 2 в ферментационной жидкосж.В табл. 2 показано постепенное повьцпенне кон- центрашщ вплоть до 50 - го дня опьгга. 815 1621 22 28 11700 16800 14900 16200 149001600 19872 25400 23124 23200 214325 27700 25944 26600 32800 32200 33270 28152 30400 Зггоо 27200 305 ОО 9 43 ре 2. 4В табл, 3 показан один иэ вариантов постепен.ного нарастания концентрации витамина В,вежедневно отбираемых порциях ферментационнойжидкости. аблица 22632 19320 40424 21016 21200 10 11 4950 31600П р н и е р 3. Ферментатор с полезным объемом 10 л, снабженный трубкой для отвода газа, запол. 2 О няют 4500 мл ферментационной жидкости, получаемой известным способом посредством полу.непрерывной ферментации со смешанной меэофиль.ной метанпроизводящей бактериальной популяцией при использовании упомянутой в примере 1 нита. 25 тельной среди МВ содержащей 9940 мкг на 1 л витамина В,. Затем вводят при 32 С добавку в виде 500 мл бактеривльного концентрата, содержащего 88000 мкг/л витамина В При этом этот концентрат берут из другого ферментатора. К 500 мл рабочей среды, содержащей теперь 18500 мкг/л витамина В, з, добавляют 500 мл пита.тельной среды йВ,О и 75 мл метанола питательной среды ИВ,а и 75 мл метанола. На второй и третий день ферментации жидкость не отбирают и осу. 35 ществляют ежедневную добавку лишь 75 мл ме.тавола.С 4-го по 10-ый день отбир ют соответственно по 500 мл ферментационной жидкости и заменяют тем жь объемом питательной среды МВ, и 75 мп метанола, 40 В 11-ый день при той же порции отбнраемой жидкости добавляют снова концентрированной питательной среды МВ, е и обычное количество метанола. Далее цикл повторяется, как в приме П р и м е р 4, Промышленный ферментатор с 50 мэ полезного объема заполнен 50 мэ ферментацновной жидкости, служащей исходной средой, получаемой аналогично первым примерам и содержащей 9936 мкг/л витамина В,В первые три дня согласно изобретению добавляют по 25 л метанола, (для облегчения перемешивания метанола и устрв. пения локальной избыточной дозировки целесо. образно разбавлять метанол добавкой двух. трехкратного количества воды, в этом случае, однако, следует отбирать соответствующий объем ферментационной жидкости с тем, чтобы избежать превышения всего объема). На четвертый день отбирают 5 м ферментационной жидкости, добавляют равный объем питательной среды ЙВ, в и 400 л метанола, Затем на 10 - ый, 14, 21 и 27 - ой дии отбирают снова 5 м ферментационной жидкости (добавляя обычное количество метанола), а на 5-9 - ый, ,11- 13-ый, 15-20-ый и 22-26-ой дни добавляют только метанол в указанной последовательности. С 27 дня начинается обычный периодический цикл, т,е. на 27, 33, 42, 46, 50, 59, 65 и 75 дни добавляют беэ отбора жидкости лишь метанол, а в остальные дни ферменгационного процесса, проводимого вплоть до 77 дня, отбирают по 5 м ферментационной жидкости и зто количество заменяют равным объемом питательной среды МВ,. Количество ежедневно вводимого метанола составляет максимально 750 л, при этом соответствующие количества определяют по табл, 1.Содержание витамина В, в ферментационной жидкости составляет приьа:рно 30 000 мкг/л. С 46 - го дня до конца опыта было получено среднее 13 14 17г 1 22 2329 30 33 3437 43 27000 33400 згооо 36310 36690 35548 35880 30968 39800 33450 34166 36250 36200 28900 35780 30360 ЗО 8 ОО 33000 30500 ззооо523129 10 Составитель М. ЛаринаТехред А, Богдан Корректор А. Кравченко Редистор т, девятко Тираж 54 Подписное ЦНИИПИ Государстве нного коьетета Совета Министров СССР но делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Ратпккая наб., п. 4/5Заказ 23441697 Филиал ППП "Патент", г. Уъзтч 1 оп, ул. Проектная, 4 значение (липа с небольшим отклонениемм) 32750 мкгл,Формула изобретения 1, Способ получения ферментационной жщ- кости, содержащей витамин В,з, путем аназробной ферментации смешанной культуры аназробных метановых бактерий на питательной среде в при. сутствни метанола, отлича ющийся тем, что, с целью увеличения концентрации бактерий в фер. ментационной жидкости и,соответственно, повышения выхода витамина В,а, ферментацию осу. ществляют постадийно: на нервой стадии проводят отбор ферментационной жидкости в количестве 5 - 15% с заменой ее концентрированной питатель. ной средой, содержащей необходимые питательные вещества, преимушественно десятикратной кон.пентрацни, к метанолом в козшчестве 0,5 - 1,5 об,%,на второй, преимущественно через 24 ч - без отборажидкости с введением метанола 0,5-1,5 об.%, натретьей стадии - в последующие 5-10 дней вновьосуществляют отбор 5-15% ферментационнойжидкосв с добавлением 0,5-1,5 об.% метанола исоответствующего отобранному количеству жил.кости обьема питательной среды,2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтоконцентрированную питательную среду вводят призначениях рН среды преимущественно равном5,5-5,8.Источники информации, принятые во вниманиепри зкспертизе:1. Патент Австрии 1 яе 266311, кл, 30 Г 9, опуб.лик. 1969.2. Авторское свидетельство Мф 338114,кл. С 12 0 5/06, заявя. 1969,20