Способ очистки вируссодержащей суспензии

О П И С А Н И Е (1) 54 з 674ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(46) Дата опубликования описания 18.05.77 51) М. Кл.е С 12 К 7/Оо осударственный комитетСовета Министров СССРпо делам изооретеннйи открытий 53) УДК 616.988.43(72) Авторы изобретения Дудников, П, А. Гембицкий и Н. А. Улупо к сесоюзный научно - исследовательский ящурный инстит 1) Заявитель(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ ВИРУССОДЕРЖАЩЕЙ СУСПЕНЗИИ арир логичес.и вирус- елков и вснных соде р. ря на пензия ко ися вредкачест- бъемов Изобретение относится к очистке би их смесей, в частности к способам очиссодержащих суспензий от белластных жиров.Известные способы очистки подразделяются на три группы: физические, химические и физико-химические. Для очистки, например, вируса яшура широко используются физико-химические методы, в частности хлорированные и фторированные углеводороды и двухфазные системы полимеров 111. Однако эти методы имеют низкую производительность, сложны в исполнении и не обеспечивают необходимой степени очистки вируса при использовании больших объемов вируса в производственных условиях.Известен также промышленный способ очистки вируссодержащей суспензии, например, вируса ящура, с помощью хлороформа 21.Сущность этого способа состоит в следующем.Готовят 10 -ную вирус содержащую суспензию из тушек 2-3-дневных крольчат. После размола и экстрагирования в суспензию добавляют 5% хлороформа,. который тщательно эмульгируют в суспензии с помощью коллоидных мелыгиц. Затем хлороформ и денатурированные белки удаляют ссванием или центрифугированием.Однако очистка лапинизиров;шпогоящура с помощью хлороформа в производс5 условиях не позволяет получать суспензиюжанием белка ниже 150 мг 5,при этом несммногократное сепарирование очигценная, суимел высокую мутность.Кроме того, хлороформ является ле10 паряющейся жидкостью, а его пары являютными для человека,Целью изобретения является повышениева очистки при использовании больших овируса. Это достигается тем, что в известном спосоое очистки вируссодержашей суспензии, например, вируса ящура, включающем операцию обработки суспензии вируса химическими реагентащ, в качестве химического реагента используют полиэтиленимин в виде 5-10%-ного раствора, рН 7,4 - 7,8, который добавляют в вируссодержа:цую суспензию при пос. тоянном перемешивании до конечной концентрации 0,025 - 0,1% с последующим центрифугированием или сег.арированием суспензии.При этом полиэтиленимин используют с мол.в, равным 10000-70000.Полиэтиленимин, как катионный полиэлектролит,преципитирует белки в нейтральной и щелочной средах вследствие изменения их эффективных зарядов и электрокинетического равновесия в растворе. Для достижения этого эффекта необходимо создать определенную концентрацию полиэтиленимина, зависящую от количества белка в суспензии. Такой способ очистки не требует специального оборудования, которое играет решающую роль при очистке вируссодержащей суспензии хлороформом, Флоккулированные полиэтиленимином белки и жиры осаждаются низкоскоростным центрифугированием или сепарированием, В противоположность очищенной хлороформом суспензия, очищенная полиэтиленимином, не имеет мутности.Полиэтиленимин может быть использован для очистки вирусов, чувствительных к растворителям жиров,Выбор молекулярного веса полиэтиленимина в пределах 10000 - 70000 обусловлен тем, что флоккулирующая активность полиэтиленимина возрас. тает с увеличением молекулярного веса, однако и стоимость полиэтиленимина также увеличивается с увеличением молекулярного веса.Способ осуществляют следующим образом, Для очистки вируса яшура раствор полиэтиленимина с мол.в. 10000-70000 разбавляют дистиллированной водой и 5 н, раствором соляной кислоты до концентрации 5 - 10% и рН 7,4 - 7,8. Раствор полиэтиленимина, выпускаемый химической промышпенностью и разбавленный для очистки вируса, хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при 2-10 С, Суспензию лапинизированного вируса яшу. ра готовят путем измельчения (размола) тушек или цельных неразделанных крольчат в смеси с фосфатным буферным раствором или буферным физиоло. гическим раствором хлористого натрия в отношении 1:10. При непрерьвном перемешивании суспензии в нее добавляют раствор полиэтиленимина до концентрации 0,0250,1%. Затем для удаления флоккулята вируссодержащую суспензию центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение 20-10 мин или сепарируют,Количество белка в очищенной суспензии определяют на спектрофотометре при длине волны280 нм с использованием калибровочной кривой,построенной на растворимые белки ткани крольчат.В данном случае метод Лоури не применим в связи5с тем, что полиэтиленимин образует с ионами медикомплексное соединение синего цвета,10%- ная суспензия вируссодержащей тканикрольчат содержит в среднем 1000 - 1200 мг.% белка,в том числе 380 - 420 мг.% растворимых белков.10Результаты очистки 10 о-ной суспензии лапинизированного вируса ящура полиэтиленимином приведены в табл,1. Приведенные в таблице данныепоказьвают, что очищенная полиэтиленимином суспензия содержит 117 - 55 мп% белка.5 Увеличение концентрации полиэтиленимина вдва или три раза не сопровождается пропорциональным снижением количества белка.20Инфекционность суспензий лапинизированноговируса до и после очистки полиэтиленимином определяют заражением мышат-сосунов десятикратными разведениями суспензии. Результаты опытовприведены в табл, 2,25Данные табл,2 показьвают, что очистка суспен.зии сопровождается незначительным снижением ееинфекционности, Величина молекулярного веса по.лиэтиленимина в этом снижении роли не играет, какне играет роли и модификация полизтиленимина.30 Снижение инфекционности связано с ионной силойраствора.Иммуногенность противоящурных вакцин излапинизированного вируса, очищенного полиэти.ленимином, определяют на взрослых белых мышахЗ 5по 50 о-ной защитной дозе (Имело). Результатыопытов приведены в табл,З.Данные табл,З свидетельствуют что очисткалапинизированного вируса ящура полиэтиленимином позволяет получать высокоиммуногенную вак 40 цину. Причем иммунизирующая доза на фосфатномбуферном растворе равна 0,04 . 0,32 мл, Большаяразница в иммуногенности вакцин обусловлена тем,что при очистке суспензии вируса используют полиэтиленимин, нефракционированный или содержащив45инициаторы полимеризации, Иммунизируюшая дозааналогичной вакцины при очистке вируса хлороформом равна 0,500,12 мл.543674 10Таблица 3 1. Способ очистки вируссодержащей суспензии, :апример, вируса ящура, включающий обработку успензии вируса химическими реагентами, о т л и.а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения качеста очистки при использовании больших объемов ,ируса, в качестве химического реагента испольуют полиэтиленимин в виде 5-10 -ного раствора, Н 7,4 - 7,8, который добавляют в вируссодержацую суспензию при постоянном перемешивании до :онечной концентрации 0,025 - 0,1% с послеующим центрифугированием или сепарированием успензии. Составитель д. АлексеенокТехред О .Лугорая Корректор И. Гоксич Редактор Д. Пинчук Тираж 578 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров ГССР ло делам изобретений и открыл ий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д, 4,5Заказ 6125/53 Филиал ППП "Патент", . ужгород, ул. Проектная. а Формула изобретения 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтополиэтиленимин используют с мол. в. 10000-70000,Источники информации, принятые во вниманиепри экспертизе; 1. "Временное наставление по изготовлению иконтролю противоящурной вакцины А, з", утверж.35 денное Главветупром МСХ СССР, 23,03.197 1 (прототип) . 2. Гринин А. С., Титов И. Н. "Очистка,концентрирование и фракционирование вирусов животных",М., "Колос", 1971,