Флуориметрический способ определения тиосоединений

О 1 ОЗ СОВЕТСКИХ ОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 19) (Н) 23",В БИБЛЯОТЕИЕТЕ ическои а гсго 1 епшегси 1954,е и идриль в. - М Ьой епсе4,вительопределевместномской хиГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ С ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТН ОПИСАНИ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕПЬСТ(71) Отделение Института химфизики АН СССР(56) Воуег Р.Э. Брес 1 горЬо 1 оше 1пчея 1 цаСоп о геас 1 опя о ряц 11 Ьуйг 1 ягоиря Ы 1 Ь огдапсгу сошроипйя 3, йп. Селеш. Бос,ч. 76, р. 4331-4336Торчинский Ю.М. Сульфгдисульфидные группы белко"Наука", 1971, с. 229.КагыяЬ Р., а.о Ап. Аяяау Ме 1Гог Ияи 1 Ые Оголя Ъу Р 1 иогеЯипс 1 шпд. "Апа 1 у 1, ВосЬеш". 19у. 9, р. 100-114,Миронов Г.П. и др. Чувстный флуориметрический методния БН и Б-Б групп при их соприсутствии. Вопросы медицинмии, 1971, т. 17, с. 83-88.(54)(57) ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ011 РЕДЕЛЕНИЯ ТИОСОЕДИНЕНИЙ в нейтральной среде, включающий измерение степени тушения флуоресценции флуоресцеиндимеркуриацетата (ФДМА) при егореакции с тиосоединением, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюрасширения класса определяемых тиосоединений, как водорастворимых, таки растворимых в органических растворителях, смешивающихсяс водой, одновременного определения концентрациикласса тиосоединений и расстояниямежду атомами серы в случае дитиолов,реакцию ФДМА с тиосоединением проводят при концентрации ФДМА 10 -10 моль/л, степень тушения флуоресценции ФДМА измеряют сравнивая флуоресценцию ФДМА с флуоресценцией впробах, в которые добавляют тиосоецинение в мольном соотношении от0,05 до 5 ФДМА, строят зависимостьстепени тушения флуоресценции.от объема прибавленного соединения и поточке эквивалентности, соответствующей излому в укаэанной зависимости,определяют концентрацию и судят оклассе тиосоединений и расстояниимежду атомами серы в дитиолах.1 1029723 2Изобретение относится к области его реакции с дисульфидами в, щелоч- аналитической химии, преимуществен- ной среде, За реакцию тушения ответно аналитической биохимии, и может ственно, в частности, образование быть использовано как экспресс-ана- ковалентной связи между ртутью и атолиз в лабораторных и производственныхмами серы. Степень тушения связывают условиях для определения концентрации с количеством дисульфидных групп, растворимых в воде или растворителях, Недостатки этого способа следую- смешивающихся с водой, сульфидов, ор- щие: возможность определения этим ганических тиолов дитиолов дисуль- способом только концентрации дисульУ10фидов, а также одновременно для от- фидов в белках, т,к, калибровочная несения анализируемого тиосоединения зависимость рассчитана только на это; к одному из перечисленных классов и невозможность выполнения количестэпределения расстояния между атомами венных измерений в присутствии туша- серы в растворе в случае дитиолов.щих флуоресценцию ФДМАпримесей. КВ аналитической химии и биохимии недостаткам этого способа относится часто ставится задача определения также проведение реакции в сильно класса и количественного содержания щелочной среде, что способствует осперечисленных тиосоединений, Однако, вобождению в белках каких-то дополни- существующие до настоящего времени тельных групп, которые тушат флуорес"20способы трудоемки, не позволяют сде- ценцию и мешает точному количественлать различие между этими классами ному определению дисульфидов. тиосоединений и в ряде случаев не- Все перечисленные способы не по- пригодны при анализе этих соединений. зволяют дифференцировать классы тиоИзвестен спектрофотометрическийсоединений и определять расстояниес.5способ Бойера, основанный на измере- между атомами серы в случае дитиолов. нии прироста оптической плотности в Ближайшим к изобретению по суп- области 250-255 нм,который происхо- ности и достигаемому эффекту являетдит при присоединении п-меркурибензо- ся флуориметрический способ опредеата к БН-группам. ления тиосоединений в нейтральнойНедостатками этого способа явля-среде, включающий измерение степени ется: невозможность определения тио- тушения флуоресценции флуоресцеиндилов, сильно поглощающих при 250- . меркуриацетата (ФДМА) при его реак нм невозможность применения в ции с тиосоединением. Способ основан присутствии примесей (например, Б-ме- на измерении тушения флуоресценции тилформамида), поглощающих при 35 ФДМА при его реакции с монотиолом 250 нм; невозможность определения при рН 7,4. За реакцию тушения ответтиосоединений при концентрации их ме- ственно образование ковалентной свя нее 310 М, зи между ртутью и атомами серы. По-.Известен также амперометрический данному способу при рН 14 определяспособ, основанный на измерении ион ют также дисульфиды или смесь диной проводимости в электрохимической сульфидов с монотиолами. ячейке раствора тиола, титруемого По указанному способу для опредераствором АяБО , когда все БН-груп 3 Ф ления концентрации монотиолов в стекг, б. пы блокируются, в растворе появляют- лянный стакан вносят 1,5 мл 1 10 М ся свободные ионы металла и, как 45 раствора ФДМА, 0,1 - 1,5 мл исследуемо- следствие, диффузионный ток., го образца, 1,5 мл 0,05 М трис-НС 3. -Чувствительность способа - 0,1- буфера (для создания рН 7,4). Конеч мкмоля тиосоединения. К недостат- ный объем доводят до 4,5 мл бидискам этого способа относятся невысо- тиллированной водой. Параллельно стакая чувствительность и способность яп вят контрольную пробу, в которой меркаптидов серебра дополнительно объем образца компенсируют водой, связывать ионы Ар с образованием После инкубации в течение 15-20 мин+комплексов типа (ВБ-Ад)Ад 1 . Обра- по интенсивности тушения флуоресцензование таких комплексов объясняет ции при рН 7,4 определяют количество завышенные результаты при титровании бб БН-групп по калибровочной кривой, Кацистеина и других соединений. либровочная кривая строится по восИзвестен способ, основанный на становленному глутатиону в параллель- измерении тушения флуоресценции флу- ных пробах при повышении мольного сооресцеин димеркуриацетата (ФДМА) при отношения глутатиона и ФДМА от 0 доз 1 О1. Максимальная относительная ошибка:2-4%.Недостатками прототипа являются:невозможность определения концентрации дитиолов и сульфидов, так каккалибровочная кривая, рассчитана только на анализ монотиолов, невозможность определения по этому способукласса тиосоединения, а также расстояния между атомами серы дитиола врастворе. Реакция проводится тольков водной среде, анализ монотиолов -не по методу параллельных проб, а поединичной точке.Определение концентрации тиосоединений в одной пробе при отношениимонотиола к ФДМА, меньшем 1, является серьезным недостатком способа,так как вид калибровочной кривой зависит от класса тиосоединения, и прианализе тиосоединений неизвестногокласса (монотиолы, дитиолы. сульфиды)нельзя определить концентрацию,Цель изобретения - расширениекласса определяемых тиосоединений,как водорастворимых, так и растворимых в органических растворителях,смешивающихся с водой, одновременное определение концентрации тиосоединений и определение расстояниямежду атомами серы в случае дитиолов.11 оставленная цель достигаетсятем, что при флуориметрическом определении тиосоединений в нейтральнойсреде способом, включающим измерениестепени тушения флуоресценции флуоресцеиндимеркуриацетата (ФДМА) приего реакции с тиосоединениями, реакцию ФДМА с тиосоединением проводятпри концентрации ФДМА 1 О -10 4 моль/л,степень тушения. флуоресценции ФДМАизмеряют, сравнивая флуоресценциюФДМА с флуоресценцией в пробах, в кбторые добавляют тиосоединение в мольном соотношении от 0,05 до 5 к ФКА,строят зависимость степени тушенияфлуоресценции от объема прибавленного соединения и по точке эквивалентности, соответствующей излому в указанной зависимости, определяют концентрацию и судят о классе тиосоединений и расстоянии между атомами серы в дитиолах,Способ осуществляют следующим образом. ФДМА растворяют в 1,5 мл0,01 и. раствора БаОН в воде, прибавляют для нейтрализации 1,5 мл 0,5 М(моль/л) фосфатного буфера рН 7,0, 29723 4 флуоресценции. Тушение флуоресценции и в том, и в другом случае оценивают по уменьшению интенсивности флуоресценции в точке максимума флуоресценции. Строят график зависимости степени тушения (%) от объема (мл) тиосоединения в пробе. Степень тушения (%) рассчитывают по формуле 35 40.100%,1где 1 - интенсивность флуоресценцииФДМА в контроле (проба У );1 - интенсивность; флуоресценции в опытной пробе (пробыВ 2-10); 45 Точка эквивалентности соответствует излому зависимости степени тушения флуоресценции от объема тиосоединения в пробе. 50 Концентрацию тиосоединЕния в точке эквивалентности определяют по формуле:Т 1 7 =(ФДМА 1 7, где ( Т 1 и (ФЛМА - молярные концентрации тиосоединения и ФД 4 А соответственно;7 и 7 - объемы (мл) тиосоединения и ФДИА соответственно. фильтруют полученный раствор, Разводят раствор ФДМА до 10 М 0,05 М фос"фатным буфером рН 7,0. В 10 пробирокразливают ФДМА (по 0,3 мл в каждуюпробирку), раствор тиосоединения в0,05 М фосфатном буфере прибавляютв пробирки У 2-10 возрастающими дозами: например, начиная с 0;05 или 10,0, мл и увеличивая объем дозы на0,1 мл - от 0,1 меля до 3-5 молейтиосоединения на моль ФДМА. Затем доводят объем раствора в пробиркахМ 1-10 до 3 мл 0,05 М фосфатным буфером рН 7;О, и через 5-20 мин записывают спектр флуоресценции ФДМАна спектрофлуориметре (например,йппсо-Вощпап) при возбуждении450 нм.В случае тиосоединений, не растворимых в воде и растворимых в органических растворителях, смешивающихся с водой (например, в спирте илиМ-метилформамиде), после прибавлениятиосоединения в этом растворителе впробирки М 2-10, во все пробирки(М 1-10) прибавляют этот раствори"тель до его объема в пробирке У 10,затем доводят общий объем в пробирках М 1-10 до 3 мл 0,05 М фосфатнымбуфером рН 7,0 и записывают спектр5 10297На фиг. 1-9 изображены зависимости степени тушения флуоресценции отобъема тиосоединений (фиг. 1-5, 7-9)и от расстояния между атомами серыв дитиолах (фиг, б),Так.как анализируемые тиосоединения нестойки при хранении в растворев присутствии воздуха, то в случаепримеров Р 1-6, 9-11 концентрацию исходного анализируемого тиосоединенияопределяли параллельно по методу Бойера. Поэтому на фиг, 1-5, 7-9 длябольшей наглядности отложены не млтиосоединения, а отношение молярнойконцентрации тиосоединения, определенной по методу Бойера, к молярнойконцентрации ФДМА, На оси ординат отложена степень тушения в Е. Стрелками показаны точки эквивалентности.П р и м е р 1 (фиг. 1). Определение концентрации сульфида Ба.Кристаллы 11 аБ 9 Н О марки х,ч, высушивали в течейие суток в вакуумэксикаторе над ИаОН. Непосредственноперед анализом готовили 10М раствор .БаБ в 0,05 М фосфатном буферерН 7,2. Определение концентрации проводили как описано в методике, нопри рН 7,2 и в 8 параллельных пробах,На фиг. 1ФДМА=10 М;Иа Б 1 - молярная концентрация Иа Б.гП р и м е р 2 (фиг. 2). Определение концентрации монотиола - восстановленного глутатиона,Восстановленный глутатион фирмы1 11Неопа 1 хроматографически гомогенный хранили в вакуумированном сосудена холоде. Непосредственно перед анализом готовили 10 фМ раствор глутатиона в 0,05 М фосфатном буфере рН7,0. Определение концентрации прово 40дили, как описано в методике прирН 7,0, но в 12 параллельных пробах.На фиг, 2 Г ФРА.1=10 М; СГТ 3 - молярная концентрация глутатиона.45П р и м е р (фиг. 3). Определение концентрации монотиола-меркаптоэтанола в присутствии этилового спирта.2-Меркаптоэтанол фирмы "Р 1 п 1 са" 98% чистоты (6 =1,115) разводили этиловым спиртом до концентрации10 М. Определение концентрации проводили, как описано в методике, в присутствии этилового спирта, в 8 параллельных пробах, но использовали 0,05 М фосфатный буфер рН 6,7.На фиг. 3 Г ФДМА.1=10 М; 1 М 33 - молярная концентрация меркаптоэтанола. 23 6П р и м е р 4 (фиг. 4),Огределение концентрации дитиола - дитиотреитола.Дитиотреитол фирмы "Бегуа" растворяли в 0,05 М фосфатном буфере рН7,0. Определение концентрации проводили как описано в методике при рН7,0. На фиг. 4 1. ФДМА)=10 М;ДТТ 1 -молярная концентрация дитиотреитола.П р и м е р 5. (фиг. 5). Определение концентрации дитиола - дигидролипоевой кислоты в присутствииэтилового спирта.Использовали 10 М раствор дигидролипоевой кислоты в спирте, приготовленный в атмосфере Аг. В связи слегкостью окисления дигидролипоевойкислоты во время отбора проб пипеткой через раствор пропускали Аг, Определение концентрации проводили,как описано в методике, в присутствииэтилового спирта, но использовали0,05 М фосфатный буфер рН 67. Нафиг5 1. ФДЯ.1=10 М;ДГЛК.1 - молярная концентрация дигидролипоевой кислоты.П р и м е р б. Определение концентрации дисульфида - липоевой кислоты,Концентрацию раствора липоевойкислоты фирмы "Р 1 ыХа" определяли после ее восстановления в дигидролипоевую кислоту боргидридом натрия, Определение концентрации дигидролипоевой кислоты проводили, как описанов примере 5 (фиг 5). Получена зависимость, аналогичная фиг. 5.П р и м е р 7. Определение концентрации дитиола-дитиотреитола в присутствии И-метилформамида,Определение концентрации дитиотреитола проводили, как описано в примере 5, но вместо этилового спиртаиспользовали Б-метилформамид. Получена зависимость, аналогичная фиг. 4.П р и м е р 8 (фиг, 6). Определение -класса тиосоединений, и в случае дитиолов - расстояния между атомами серы в растворе.По данным примеров 1-5, повторенных 3 раза, нашли, что каждому классу тиосоединений соответствует в точке эквивалентности определенная сте"пень тушения флуоресценции 10 МФДМА. В случае сульфидов степень тушения флуоресценции 10 М ФДМА в точке эквивалентности составляет 85-957;монотиолов 45-55%, дитиолов 65-807,По данным примеров 1-5, повторенных 3 раза, построили график зависи23 8между атомами серы в растворе больше, чем в случае дитиотреитола, имеющего 4 СН -группы, которые могут присоединить 2 молекулы ФДИА в свернутой конформации. Калибровочные зависимости, аналогичные фиг. 6 можно сделать для всей области концентраций ФДМА, при которой возможно определение концентрации (10 -1 ОМ),Однако, как будет показано ниже в примерах 9-11, нужно учитывать, что предельное тушение зависит не только от класса тиосоединения, но и от концентрации ФДИА в точке эквивалентности.П р и м е р 9 (фиг. 7). Определение концентрации восстановленного глутатиона при концентрации ФДМА 10 6 И.Определение концентрации проводили, как описано в примере 2 (фиг. 2), в фосфатном буфере 0,05 И рН 7,0 в 11 параллельных пробах за тем исключением, что во всех точках концентрации ФДМА и глутатиона были в 10 раз меньше, Сплошная линия на фиг. 7 измерения сделаны через 15 мин после смешивания; прерывистая линия - через"4 ч. Из фиг, 7 видно, что и при этой концентрации ФДМА реакция доходит до конца и за 15 мин; через 4 ч наблюдается не дополнительное тушение, а некоторое возгорание флуоресценции. На фиг. 7ФДИА 3=10 6 М;1 ГТ 1 - молярная концентрация .глутатиона, Видно, что точка эквивалентности в этом случае выявляется хуже, чем в случае 10 М ФДИА (пример 2). Тушение в точке эквивалентности в этом случае меньше, чем при 10 М-5 ФДМА (пример 2).П р и м е р 1 О (фиг. 8). Определение концентрации восстановленного глутатиона при концентрации ФДИА10 М.Определение концентрации восстановленного глутатиона проводили, как описано в примере 2 (фиг, 2), в фосфатном буфере рН 7,0, в 8 параллельных пробах, но во всех точках концен. трации ФДМА и глутатиона были в 100 раз меньше,.На фиг. 8 ГФДИА= =10 И; 1 ГТ 3 - молярная концентрация глутатиона, Сплошная линия измерения сделаны через 15 мин после смешивания; прерывистая линия - через 4 ч. На оси ординат отложен процент остаточной флуоресценции: 1- ; 100,1 7 10297мости средней из 3 опытов степени ту"шения в точке эквивалентности от расстояния в растворе между атомами серыов точках присоединения ФДМА, в А(фиг. 6). Цифры возле точек на фиг.6соответствуют следующим тиосоединениям: 1 - сульфид натрия; 2 - дитиотреитол; 3 - дигидролипоевая кислота; 4, 5 - монотиолы - восстановленный глутатион и меркаптоэтанол, Расстояние между атомами серы (в точкахприсоединения ФДМА) в растворе в дитиотреитоле идигидролипоевой кисло те, модифицированных ФДМА, равныо осоответственно 4 А и 4,5 А, определили из их моделей по Стюарту-Бриглебу. В случае Ба Я на фиг. 6 отлоожено расстояние (1,6 А) между точками присоединения ФДИА к Ба Я, определенное также из модели по СтюартуБриглебу. Из фиг. 6 видно, что приорасстоянии более 9,5 А между атомамисеры в растворе дополнительного посравнению с монотиолами (точки 4, 5)тушения наблюдаться не будет,По фиг. б можно определять расстояние между атомами серы дитиоловв растворе, если оно не превышает9,5 А. В основе этого определения лежит обнаруженное в данной работеуменьшение квантового выхода ФДМА(т,е. уменьшение интенсивности флуоресценции) за счет взаимодействиямолекул ФДМА, связанных сульфидомили дитиолом, видимо, в результатевозможно изменение квантового выхода флуоресценции за счет образованияпары молекул ФДМА. Параллельно суменьшением интенсивности флуоресценции ФДМА при реакции с сульфидомили дитиолом происходит смещение мак 40симума флуоресценции ФДИА от 520 нмна несколько нм в сторону короткихволн; параллельно происходит уменьшение интенсивности и изменение формы линии в спектре поглощения ФДМА.45Известно, что алифатические соединения легко принимают в растворесвернутую конформацию, и расстояниемежду атомами серы в растворе будетопределяться легкостью сворачиваниямолекулы, Это наглядно проявляетсяФв случае дитиотреитола и дигидролипоевой кислоты. Последняя, имея лишь3 СН. - группы между атомами серы,судя по модели по Стюарту-Бриглебу,не может присоединить 2 молекулыФДМА в свернутой конформации, и вслучае этого соединения расстояние9 10ФДМЛ.1=10 М;ГТ 3 - молярная .концентрация глутатиона. На фиг. 8 видно,что в этом случае практически невозможно установить точку эквивалентности. Предельное тушение в этом случае-5меньше, чем при 10 М ФДМА (пример 2)и 10 М ФДМА (пример 9),П р и м е р 11 (фиг. 9). Определение концентрации дитиола - дитиотреитола при концентрации ФДМА 10 М.Определение концентрации дитиотреитола проводили так, как описанов примере 5, но испольэовали фосфатный буфер 0,05 М рН 7,2 и концентрации ФДМА и дитиотреитола были в10 раз больше во всех точках. Йафиг, 9 С ФДМА.1=10 М;ДТТ 1 - молярная концентрация дитиотреитола,На фиг. 9 видно, что при этой концентрации можно проводить определение. Однако нужно учесть, что приэтом будут расходоваться большие количества ФДМА и тиосоединений, чтоменее экономично, чем при проведении титрования при 10 М (с этим связано малое количество точек).Предельное тушение в этом случаебольше, чем при 10 М (пример 5).При рН выше 7,2 или ниже б,7 вовсех случаях реакция тиосоединения сФДИА проходит не полностью из-за ча"стичного гидролиза при этих рН об.разующейся связи серы со ртутью, чтоприводит к ошибкам при определенииконцентрации тиосоединений. 29723 10Описываемый способ имеет следующие преимущества: способ прост в выполнении, высокопроизводителен, нетребует сложных методов расчета иаппаратуры для идентификации тиосоединений и может быть рекомендован в .качестве экспресс-метода для широкого применения в лабораторных и производственных условиях. Применение 1 О способа может ускорить решение научных вопросов, связанных с идентификацией и количественным анализом тиосоединений, играющих важную роль вбиохимии; способ более информативен 15 по сравнению с существующими, так какпозволяет по одним и тем же параллельным пробам получить величину концентрации, определить класс тиосоединений и в случае дитиола, определитьрасстояние между атомами серы, и таким образом исключает применение нескольких независимых методов для определения концентрации, класса тиосоединений и расстояния между атомами 25 серы в дитиоле, способ позволяет определять сульфиды, монотиолы, дитиолы,дисульфиды, способ позволяет использовать в качестве растворителя и воду, и органические растворители, сме шивающиеся с водой, на основании пп.11-5 видно, что способ дешевле в 3-4раза по сравнению с существующимиспособами, проведение которых требует нескольких независимых анали-зов.:аз 445 ВНИИПИ Государс по делам изобре113035, Москва, Жного комии.й и откр аулская наб д Производственно-полиграФическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектна 3 ЕПЗ ЕфЮ