Способ количественного определения микроорганизмов

(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ(57) Изобретение относится к микробиологии и позволяет сократить времяисследования и повысить точность определения микроорганизмов. Анализируемую жидкость смешивают с иммуносорбентом, инкубируют, сорбент промываютфосфатным буфером. Иммуносорбент сосвязанными клетками обрабатывают щелочным раствором додецилсульфата натрия в концентрации 10 5 -10М, Хемилюминесцентным методом с помощью люминола и перекиси водорода определяютвыделенный гемин. Количество клетокв образце определяют по калибровочнойкривой зависимости интенсивности излучения от содержания клеток в стандартных растворах.(21) 3 (22) 3 арилова,Л.Ю, и деления икробиол икладная 1985, У ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ИСАНИЕ ИЗОБР 960911/28 140.09.85(56) Карулин А.Ю., СтепинИспользование ИФА для опрпосторонней микрофлоры вгическом производстве. - Пбиохимия и микробиология.1 12901Изобретение относится к способамизмерения, использующим биологическиактивные вещества, а именно специфическому способу определения количества бактериальных клеток в биологических жидкостях и культуральной среде,и может быть использовано в клинической микробиологии, микробиологической промышленности, и в других отраслях промышленности, где необходимконтроль биозараженности.Известен способ количественногоопределения микроорганизмов, предусматривающий связывание их со специфическими антителами, сорбированными 15на поверхности твердой фазы. Для проведения анализа по известному способуанализируемый образец, содержащийклетки микроорганизмов, инкубируютс иммобилизованными на твердом носителе антителами, специфическими кповерхностным детерминантам клетки(40-60 мин). Затем иммуносорбент,связавший клетки, несколько раз по5-10 мин промывают и инкубируют с антителами, мечеными ферментом.Продолжительность второй инкубации40-60 мин. После этого сорбент тщательно отмывают (4-5 раз в течение10 мин) от несвязавшегося конъюгатаантител с ферментом, и фермент, связанный с носителем, выявляют, определяя его активность. Для этого к отмытому носителю добавляют смесь субстратов (о-фенилен-диамин и перекись35водорода). Конечный результат регистрируют измерением оптической плотности окрашенного продукта реакции,нарабатываемого в течение 30 мин. Общее время анализа около 3-4 ч. Предел обнаружения,510 кл/мл.Известный способ обладает следующими недостатками: определяются нетолько целые клетки, но и их фрагменты, что существенно влияет на правильность получаемых результатов,длительность анализа,Цель изобретения - ускорение процесса и и повышение точности определения микроорганизмов.Поставленная цель достигается тем,.1 то согласно способу количественногоопределения микроорганизмов, предусматривающему связывание их со специфическими антителами, сорбированными на поверхности твердой фазы,связанные микроорганизмы обрабатывают щелочным раствором, содержащим10 -10 М додецилсульфата натрияб 7 70(ДСН), с последующим определением в полученной смеси люминесцентным методом концентрации выделившегося из клеток гемина, по которой с помощью калибровочной кривой определяют концентрацию микроорганизмов.Способ осуществляют следующим образом.Пробу анализируемой жидкости, содержащую бактериальные клетки, смешивают с иммуносорбентом. Соотношение объема пробы и объема иммуносорбента варьируется в зависимости от типа используемого сорбента и составляет 100 мкл;50 мклмкл:400 мкл. После инкубации в течение 40-60 мин, необходимой для связывания клеток с иммобилизованными антителами, сорбент промшвают три раза 0,01 М К- фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,15 М ИаС 1 и 0,057 тритона Х. После этого образец иммуносорбента со связанными клетками подвергается обработке 0,2 М раствором МаОН, содержащим 10-10М ДСН в течение 3-5 мин. В процессе этой обработки происходит разрушение клеточной оболочки и осуществляется перевод гемина с твердой фазы в раствор. Аликвота раствора затем вносится в пробирку кюветного отделения люминометра, в которую добавляются люминол и перекись водорода.Гемин катализирует реакцию окисления люминола Н 0 , сопровождающуюся2 Я физлучением света. Интенсивность люминесценции пропорциональна концентрации гемина и, следовательно, количеству клеток, связавшихся с иммуносорбентом. Количество, клеток в образце определяют по калибровочной кривой зависимости интенсивности излучения от содержания клеток в стандартных растворах.П р и м е р 1. Построение калибровочного графика и определение количества клеток Е.со 1 зКультуральную жидкость, содержащую 10 клеток/мл Е,со 11 разводят 0,01 М6К-фосфатным буфером, содержащим 0,15 М ИаС 1 в следующих соотношениях: 1:10, 1:100, 1:200, 1:500, 1:2000. Затем 0,5 мл раствора каждого разведения смешивают с 400 мкл суспензии СБВг-сефарозы с иммобилизованными антителами к Е.со 12 Смесь инкубируют при 37 С в течение 30 мин, после чего иммуносорбент промывают 0,01 М К-фосфатным буфером (рН 7,4), содер70 1:500, 1;2000, Затем 0,5 мл раствора каждого разведения смешивают с 400 мкл суспензии С 11 Вг-сефарозы с иммобилизованными антителами к Е.со 1. Инкубацию с иммуносорбентом, последующую экстракцию гемина и определение интенсивности хемлюминесценции проводят, как в примере 1. Затем строят график зависимости интенсивности хемлюминесценции от количества клеток в пробе. Образец среды, содержащей неизвестное количество клеток, разводят 1;100, после чего 0,5 мл раствора разведения инкубируют с 400 мкл иммуносорбента, отмывают, измеряют сигнал хемлюминесценции.Определение количества клеток Е.со 1 д проводят по калибровочному графику, полученному для стандартных концентраций Е.со 1 г (как в примере 1). Количество клеток Е.со 1, опрецеленное в смеси с клетками Васг 11 ця яцЬг 1 я соответствует количеству клеток, найденному по стандартному раствору в отсутствии второго микроорганизма.Оценка эффективности экстракции гемина из микроорганизмов от концентрации додецилсульфата натрия подтверждается следующими данными; КонцентрацияДСН (М) 1010 5 1010 10 Величинасигнала Суспензию, содержащую Е.со 1 и 55б10 клеток/мл Вас 11 ця яцЬгдя разводят 0,01 М К-фосфатным буфером, содержащим 0,15 М 11 аС 1 в следующих соотношениях: 1:10, 1:100, 1:200,3 2901 жащим 0,057, тритона Х. Пробирки центрифугируют, удаляют надосадок и добавляют в каждую из них 1500 мкл 0,2 М раствора ИаОН, содержащего 5 10 М ДСН и перемешивают. После-7инкубации в течение 3 мин из каждой из них отбирают 960 мкл раствора и помещают в кювету люминометра. Затем в эту же кювету автоматически вносят 20 мкл раствора люминола (10М) и 10 после 10 с инкубации реакцию инициируют добавлением 20 мкл Н 0 (5 х х 10- М), измеряют интенсивность хемлюминесценции и строят калибровочный график зависимости интенсив ности излучения от количества клеток, используемых в стандартных образцах. Содержание .клеток в стандартном.образце контролируют методом световой микроскопии. Содержание клеток в неизвестном образце (11) определяют по калибровочному графику. Предел обнаружения клеток Е.со 1 - 10 клеток/мл.П р и м е р 2. Построение калибровочного графика и определение био массы актиномицетов БГгергошусея сЬгуяоша 11 ця.Прямой подсчет клеток актиномицетов является затруднительным из-за образования агрегатов клеток неопределенного состава, поэтому определение ведут по сухому весу. Из суспензии микроорганизмов 1:2, 1;3, 1:5, 1:8, 1:10 готовят разведения (по 12 мл). Бумажные фильтры (5 шт) вы сушивают при 80 С до постоянного веса, затем на них наносят 3 мл суспензии клеток, фильтруют, фильтры высушивают в эксикаторе над СаС 1. Фильтры помещают на 1 ч в сушильныйо 40 шкаф при 80 С, взвешивают, при этом разница в весе после нанесения суспензии клеток и чистого фильтра соответствует сухому весу биомассы в 3 мл клеточной суспензии.Для определения биомассы 3 мл со 45 ответствующего разведения суспензии микроорганизмов инкубируют с иммобилизованными антителами к Бггергошусея сЬгуяота 11 ця. Далее способ осуществляют согласно примеру 1. Предел обнаружения - 5 мг/мл.П р и м е р 3. Определение клеток Е.со 1 д в смеси микроорганизмов. 4,9 8,7 8,6 5, 9 2,9 Таким образом, использование пред. лагаемого способа количественного определения микроорганизмов (по сравнению с известным) сокрашает время определения с 3-4 ч до 1-1,5 ч, повышает точность анализа за счет определения только целых клеток, а также увеличивает предел обнаружения клеток. Формула изобретения Способ количественного определения микроорганизмов путем связывания их со специфическими антителами, сорбированными на поверхности твердой фазы, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения процесса и повышения точности определения, связанные микроорганизмы обрабатывают щеСоставитель С.ЕреминТехред Л. Сердюкова Корректор Е,Сирохман Редактор А.Ревин Закаэ 7893/39 Тираж -798 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Проиэводственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 51290170 6лочным раствором додецилсульфата нат- делением его хемлюминесцентным мето 6 -7рия в концентрации 10 -10 М, с дом с помощью люминола и перекиси вопоследующим выделением гемина и опре- дорода.