Способ определения вирусов и антител к ним

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛ ИОТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК й 33/5 Б Т К ПАТЕНТ т ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(56) Сюрин В,Н; и др. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных.МАгропромиздат, 1986, с. 207-208.(57) Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано при диагностических исследованиях . для определения вирусов или антител к ним,Изобретение относится к области вирусологии и может бытьиспользовано при диагностических исследованиях для определения вирусов и антител к ним,Целью изобретения является ускорение и упрощение способа, повышение его чувствительности и универсальности,Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения вирусов и антител к ним в реакции нейтрализации, включающем смешивание вируса с сывороткой, внесение этой смеси в систему репродукции вируса, ее инкубацию и уче результатов реакции, в соответствии с изобретением инкубацию смеси вируса с сывороткой в системе репродукции вируса ведут в течение 15-20 мин при 36-38 ОС, затем в нее добавляют флуоресцентный зонд и че. рез 12-15 мин осуществляют учет реэульта 1787272 А Цель изобретения - ускорение и упрощение способа, повышение его чувствительности. Цель достигается тем, что получают смесь из равных обьемов вируса и сыворотки, которую вносят в систему репродукции вируса и инкубируют 15 - 20 мин при 37 С. В смесь добавляют флуоресцентный зонд со временем экспозиции 12-15 мин. Учет результатов реакции ведут по отношению интенсивности флуоресценции смеси в опыте и контроле и при значении ее показателя, равном 1;5 и выше, определяют наличие инфекционного агента, а при значенииэтого показателя менее 1,5 в случае образования специфического комплекса "вирус-антитело" определяют наличие антител к нему. 4 табл. тов реакции по отношению интенсивности флуоресценции смеси в опыте и контроле и при значении ее показателя, равном 1,5 и выше, определяют наличие инфекционного агента, а при значении этого показателя менее 1,5, в случае образования специфического комплекса вирус-антител о определяют наличие антител к нему.Обнаружение вирусов и вирусоспецифических антител проводится по феномену торможений адсорбции вируса антителами на клеточной мембране. При образовании комплекса вирус-антитело вирус теряет сйо.собность связываться со специфическими . рецепторами клетки. В этом случае, состояние мембраны клеток не изменяется, А в случае, если остается свободный вирус, то "он аДсорбируется на клеточной мембране, что, соответственно, приведет к изменениюсостояния клеточной мембраны, котороеможно определить с помощью флуоресцентного зонда.Сущность изобретения поясняется примерами его исполнения, которые не ограничивают его обьем,П р и м е р 1, Определение типа вирусаящура.К 0,3 мл разведения испытуемой пробы(вирус ящура) добавляют 0,3 мл соответствующего разведения ящурной диагностической сыворотки. Затем, в 0,5 мл суспензииклеток ВНКвносят 0,1 мл йолученнойсмеси вирус-сыворотка и инкубируют 20мин при 37 С, Затем, в нее добавляют флуоресцентный зонд ДСМ до конечной концентрации 1,0 мкМ и выдерживают 15 мини после этого проводят учет результатов реакции. Подготовленные образцы флуориметрируют с помощью микроскопа Л ЮМАМИпри длине волны возбуждающего света405 нм и длине волны флуоресценции 515нм. Среднюю интенсивность флуоресценции (Е) клеток рассчитывают по формуле- 1 ФР= --Р 1где Г - интенсивность флуоресценции 1-ойклетки;и - число клеток (не менее 20 - 30 в каждом опыте).Для удобства ввели константу флуоресценции (К) - постоянную величину, равнуюопытаотношению опыта За положительнуюЕконтроляконстанту взяли величину, равную ипи больше 1,5, В случае, если возбудитель не нейтрализован гомологичными антителами, тоон адсорбируется на клеточных рецепторах,что приводит к увеличению интенсивностифлуоресценции зонда по сравнению со свечением его на интактных клетках в 1,5 иболее раз, При значении показателя интенсивности флуоресценции, равном 1,5 и выше, определяют наличие инфекционногоагента, Наличие вируса ящура определяютв течение 40 мин. Вирус ящура относят ктому типу, какими антителами он нейтрализован.П р и м е р 2. Определение антител квирусу ящура,К 0,3 мл соответствующих разведенийвируса ящура типов А,О и С добавляют по0,3 мл соответствующих разведений используемой сыворотки крупного рогатогоскота, переболевшего ящуром. Затем, в 0,5мл суспензии клеток ВНК - 21 вносят 0,1 млполученной смеси вирус-сыворотка и иикубируют при 37 С - 15 мин. После этого, всмесь добавляют зонд ДСМ до конечной концентрации 5 мкММ и выдерживают с зондом 15 мин. Подготовленные образцы флуориметрируют с помощью микроскопа ЛЮМАМ И - 2 при длине волны возбуждающего света 405 нм и длине волны флуоресценции 515 нм, Среднюю интенсивность флуоресценции (г) клеток рассчитывают по формуле:101игде Р - интенсивность флуоресценции 1-ой5 клетки; и - число клеток (не менее 20-30 в каждом опыте)Для удобства учета предложена константа флуоресценции (К) - постоянная ве 20 личина, равная отношению РГоп ытаЕконтроляЗа положительную константу берут величину, равную или больше 1,5. Эта величина характерна для проб, содержащихкультуру клеток, вирус ящура, гетерологичные антитела к нему и зонд. В случае нейтрализации вируса ящура гомологичнымиантителами, этот показатель меньше 1,5.Определение антител к вирусу ящура осуществляют в течение 60 мин.Эффективность способа подтвержденарезультатами экспериментов, сведения окоторых представлены в таблицах 1 - 3,В таблице 1 приведены результаты определения активности сыворотки крови,отобранной от крупного рогатого скота,привитого вакциной из лапинизированноговируса ящура А 22 с помощью флуоресцентного зонда на культуре клеток В Н К.Результаты табл. 1 свидетельствуют отом, что существует прямая зависимостьмежду дозой вируса и титром антител, Суменьшением количества вируса, использу- .емого для постановки реакции нейтрализации с помощью флуоресцентных зондов,увеличивается количество антител, т.е. титрантител,Таким образом, показано, что показатель интенсивности флуоресценции, рав 50 ный 1,5 и выше, свидетельствует о наличиивируса, а значение этого показателя меньше1,5 в.пробах, содержащих вирус+ антитепо,свидетельствует о нейтрализации вируса гомопогичными антителамиВ табл. 2 приведены данные определения антител к вирусу ящура А 22 в реакциинейтрализации с флуоресцентным зондомна культуре клеток СП в гипериммуннойсыворотке морских свинок, используемойдля постановки РСК,1787272 Таблица 1 Зависимость показателей активности сыворотки от дозы вируса ящера А 22 блица 2"титрования сывороток морских свинок к вирусуагаемым способом на культуре клеток СП Результаты "шахматн прДанные табл. 2 подтверждают показатели, представленные в табл, 1 и подтверждают, что результаты предлагаемого способа не зависят от происхождения сыворотки и культуры клеток.В табл. 3 приведены результаты опытов, свидетельствующих об универсальности предлагаемого способа. Предлагаемый способ испытан с положительными результатами на примере возбудителей 10 разных вирусных болезней, Эти вирусы относятся к 7 разным семействам, Предлагаемый способ пригоден для выявления вирусов и антител к ним независимо оттого, являются ли они РНК или ДНК-содержащими.Использование предлагаемого способа определения вирусов и антител к ним обеспечивает по сравнению с реакцией нейтрализации следующие преимущества;1) Универсальность2) Значительное сокращение времени на исследования3) Доступность, дешевизна4) Повышение чувствительности 5) Значительное упрощение постановкиопытом с имеющимися методиками6) Повышение достоверности Исследо.вания, особенно при исследовании вирусов, 5 имеющих замедленный цикл репродукции7) Воэможность обнаружения вирусов,размножающихся без видимого ЦПД.Формула изобретения Способ определения вирусов и антител 10 к ним, включающий смешивание вируса ссывороткой, внесение этой смеси в систему репродукции вируса, инкубацию ее и учет результатов, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности, уско рения и упрощения способа, инкубацию системы репродукции вируса проводят в течение 15 - 20 мин при 36 - 38 С, далее, в нее добавляют флуоресцентный зонд, экспонируют в течение 12-15 мин, определяют ин тенсивность флуоресценции, рассчитываютиндекс флуоресценции и при значении его 1,5 и выше определяют наличие вируса, а при значении его менее 1,5 определяют наличие антител к вирусу.1787272 Таблица 3 Характеристика вирусов и антител к ним, используемых для испытания предлагаемого способаСемейство ви сов Возб итель ин ек ии Составитель С.КулаковаТехред М.Моргентал Корректор А.Обручар Редактор Заказ 273 Тираж,:Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж, Раушская наб 4(5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 Ящура Болезни АУески Коронавирусной инфекции ПарагриппаКРС Вирусный диареи КРС Болезни Тешена Везикулярной болезнй свиней Лейкоза Классической чумы свинейВезикля ной экзантемы свинейПикорнавирусы герпесвирусы коронавирусы парамиксовирусы тогавирусы пикорнавирусы пикорнавирусы ретровирус тогавирусы калициви сы